3. Mutations génétiques
3.2. Variation du nombre de copies d’un gène
Les MPs ne sont pas les seules mutations pouvant modifier la régulation miR-ARNm, un changement dans le niveau d’expression d’un miR peut également modifier cette régulation. En effet, si un miR se retrouve en plus forte ou en plus faible quantité qu’initialement, la force de répression sur son ARNm cible peut changer. Des altérations du niveau d’expression de miR ont déjà été associées à la MA. Il se trouve que ce type de
changement peut être dû à des VNC117,266,267.
Chaque gène est présent en deux copies (un par allèle hérité de nos parents), mais durant la méiose, des erreurs de recombinaisons peuvent créer des VNCs257. Plus de 2
millions de VNCs ont été identifiés chez l’Homme, dont la majorité sont des délétions268.
Près de 15% du génome présente des VNCs268. Ceux-ci sont répertoriés dans des bases de
données, comme la DGV (Database of Genomic Variants), issues d’individus sains, ou DECIPHER (Genetics Home reference - NIH; https://ghr.nlm.nih.gov/) issues de données de patients atteints de maladies génétiques rares, par exemple. Afin de les identifier, diverses techniques existent comme le CGH-array (Comparative Genomic Hybridization- array) pour une analyse globale ou la QMPSF (Quantitative multiplex Polymerase Chain
Reaction of short fluorescent fragments) pour une analyse plus ciblée.
3.2.1. Techniques d’identification
3.2.1.1. CHG-array
Le CGH-array (Figure 22) consiste en une hybridation sur puce d’ADN issu d’un échantillon à tester et d’un échantillon de référence. Les deux types d’échantillons sont marqués par un fluorochrome différent permettant de les distinguer. Les fragments des deux échantillons vont s’hybrider sur une même puce à ADN contenant un large panel de gènes. Une fois hybridés, l’intensité de fluorescence émise par les fragments renseignera sur la présence de gains d’ADN ou duplication (fluorescence venant majoritairement de l’échantillon à tester), de pertes d’ADN ou délétion (fluorescence venant majoritairement de l’échantillon de référence) ou de quantités similaires d’ADN (fluorescence provenant
autant de l’échantillon à tester que de celui de référence) chez le patient versus l’échantillon de référence, pour des gènes donnés.
Figure 22 : Schéma de la technique de CGH-array
Hybridation d’un mix d’ADN provenant d’un échantillon de référence et d’un échantillon à analyser. Chaque échantillon est marqué d’un fluorochrome précis, permettant de les distinguer. Une fois hybridé sur la plaque à ADN, chaque puits de cette plaque émettra une longueur d’onde résultante de l’émission des fluorochromes des deux échantillons. La longueur d’onde résultante renseignera si l’échantillon à analyser s’est hybrider davantage (gains), moins (perte) ou autant (aucune mutation) que selon de référence. (Inspirée de V. Colaianni et al., 2016)
3.2.1.2. QMPSF
Le principe de la QMPSF (Figure 23) est d’obtenir des amplicons (fragments d’ADN
amplifiés) de tailles différentes, marquées par un fluorochrome269. Chaque taille d’amplicon
correspondra à une région amplifiée précise du génome. La taille des amplicons générés est donc calculée par l’expérimentateur avant de faire l’expérience. Ces amplicons seront ensuite séparés en fonction de leur taille, par électrophorèse. Chaque taille d’amplicon sera associée à une région du génome et le pic de fluorescence qui lui correspond renseignera sur la quantité d’amplicons générés. La hauteur des pics de fluorescence est ensuite comparée à celle d’un échantillon contrôle et rapportée sur l’amplicon d’un gène stable (très rarement muté). Si la fluorescence provenant de l’échantillon du patient est au moins 1/3 de fois plus grand que celui du contrôle, cela suggère une duplication (3 copies, ou plus, au lieu de deux), lorsque le pic de fluorescence est diminué d’environ 50% par rapport à celui de l’échantillon contrôle cela suggère une délétion chez le patient (1 copie, ou moins, au lieu de 2). Le fait d’avoir plusieurs régions amplifiées permet de borner la région du
ADN test-Cy5
ADN reference-Cy3
Similaire
Gain
Perte
Figure 23 : Exemple de résultats de QMPSF
Sept amplicons différents ont été utilisés afin de borner la région du VNC situé sur le chromosome 21. L’amplicon de référence, gène PCBD2, permet de normaliser les pics de fluorescence entre les deux échantillons. Les amplicons des gènes C21orf42 et CYYR1 ont un pic de fluorescence similaire, suggérant une absence de VNC, par contre les amplicons des gènes GABPA, APP_E18, APP_E17 et APP_E1 montrent un pic de fluorescences 1/3 plus grand chez le patient que chez le contrôle, suggérant que le patient présente une copie en plus de ces parties du génome. Le patient aurait donc une duplication au niveau de ces gènes qui ne comprendrait pas les gènes C21orf42 et CYYR1. (De A. Rovelet-Lecrux)
3.2.2. Implications sur la régulation exercée par un miR
Actuellement, des VNC sur des gènes de miRs (VNC-miRs) ont été décrit dans diverses pathologies. Warnica et collaborateurs, ont constaté que des patients souffrant de schizophrénies avaient davantage de VNC-miRs que des individus sains. De plus, ces VNC-miRs touchaient des gènes de miRs, dont le miR-185, qui pouvaient être associés à la
schizophrénie via des cibles impliquées dans le développement neuronal270. Calin et
collaborateurs, ont constaté, quant à eux, que la région chromosomique 13q14 était souvent délétée chez des patients atteints de leucémie lymphocytaire chronique. Or, cette région comprend les gènes des miRs, miR-15 et miR-16, souvent délétés ou sous-régulés (68% des
cas) chez des patients touchés par ce type de leucémie271. Enfin, Vaishnavi et
collaborateurs, ont identifié une dizaine de VNC-miRs, tels que miR-200b, miR-34a ou
Duplication Chromosome 21 Taille F luor es ce nc e Patient Control
développement neuronal et la formation synaptique272. Ces délétions ou duplications de ces miRs pourraient, selon eux, expliquer les différences de niveau d’expression de nombreux gènes fortement impliqués dans l’autisme272. D’autres VNC-miRs ont été associés à des
pathologies, comme l’uvéite antérieure chronique, un syndrome d’inflammation oculaire273,
ou à des déficiences intellectuelles274. Les VNC-miRs peuvent donc avoir de larges impacts
au niveau des neurones et du système immunitaire, entre autres, qui sont justement impliqués dans la MA. Cependant, aucune étude ne s’est encore portée sur les VNC-miRs dans la MA.
Hypothèse et Objectifs
La part de la génétique dans la MA étant prépondérante, il est d’un intérêt majeur d’étudier le génome des patients, en particulier ceux ayant des formes précoces (possèdant des facteurs de risque plus sévères). Les analyses génomiques actuelles ont permis d’identifier de nombreux facteurs de risque, élargissant nos connaissances sur la MA et ouvrant des voies de recherche pour des outils thérapeutique et/ou de diagnostic. Comme vu précédemment, de nombreux miRs sont dérégulés dans la MA et différents types de mutations peuvent être à l’origine de ces dérégulations. Notre hypothèse est donc que des mutations types MPs ou VNC-miRs pourraient altérer la fine régulation de miRs et donc de nombreux mécanismes moléculaires impliqués dans la MA. Pour répondre à cette hypothèse, nous avons étudié d’une part le rôle des VNC-miRs et d’autre part celui des MPs sur des ARNm associés à la MA qui altèrent la régulation miR-ARNm, constituant deux objectifs distincts.