Matériels et méthodes

Plasmide

Le plasmide a été généré par la plateforme d’outils moléculaires du centre de recherche CERVO. La séquence plasmidique comprend le gène MIR-138-2 : CAGCTGGTGTTG

TGAATCAGGCCGACGAGCAGCGCATCCTCTTACCCGGCTATTTCACGACACCA

GGGTTG (en gras la séquence du miR-138 mature) basé sur la base de données UCSC. L’insertion du gène s’est effectuée grâce aux amorces sens: cagcttTCTAGAggtggc taaacagttagtctaccc et anti-sens : cgatcTCTAGAagagctccatggacagagatgtct. Le plasmide fut ensuite introduit dans un adénovirus AAV2/DJ8.

Souris et injections intra-ventriculaires

Pour cette étude, 30 souris néonatales (P0) C57BL/6J de chez Jackson Laboratory ont été

injectées avec un virus AAV2/DJ8 de sérotype neuronal330. Les souris ont reçu soit le virus

AAV2/DJ8-CAG-eGFP-MIR-138-2 (n = 14, souris 138) ou AAV2/DJ8-CAG-eGFP (n = 16, souris contrôles). Ces souris ont été injectées à P0 en intracérébroventriculaire

bilatéralement à hauteur de 1010 de charge virale par hémisphère via une

seringue Hamilton de 33 gauges ou G de 5µl. Les souris ont été cryo-anesthésiées pendant 2 min avant injection. Les injections ont été réalisées à main levée, perpendiculairement à la boîte crânienne, à environ 0,25 mm en latérale de la suture sagittale, 0,50 mm rostral de

la suture coronaire et 3 mm de profondeur à une vitesse moyenne de 1 µl/sec331_{. La}

seringue fut retirée 2 min après la fin de l’injection afin d’éviter un éventuel reflux du virus. Les souris ont ensuite été placées sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil puis rendues à

leur mère. Trois souris de chaque groupe ont été sacrifiées 2 mois après injections, pour étudier le niveau d'infection et la localisation virale. Les autres souris ont été gardées 4 mois après les injections pour les tests comportementaux et cognitifs avant d’être sacrifiées. Test de SHIRPA (Smith kline beecham Harwell Imperial college Royal london hospital,

Phenotype assessment).

Le test de SHIRPA a été effectué, comme précédemment décrit332, dans une boîte

transparente Perspex (55 cm x 33 cm x 18 cm). L’aspect corporel des souris été d’abord évalué (couleur et aspect du pelage, morphologie de la tête, état des dents, aspect des yeux, aspect des vibrisses ainsi que la morphologie et la taille de la queue), puis le positionnement du corps (sauts répétés, tremblement, respiration, locomotion). Les souris ont ensuite été placées sur une grille métallique pour analyser la marche sur grillage et la force de préhension sur la grille lorsqu’elles sont tirées légèrement par la queue. La grille est retournée à 90° et 180° pour étudier les capacités musculaires des souris à saisir la grille à la verticale et à l’horizontale. Un bruit d’une tonalité de 90 décibels a été effectué à l’aide d’un cliqueur en métal pour évaluer l’audition des souris (réaction face au bruit, reflex absent, de proie, sursaut). Les souris ont été ensuite placées sur un fil métallique pour évaluer leur capacité à garder l’équilibre. D’autres signes anormaux ont été recherchés tels que des activités épileptiques, des sauts anormaux, des comportements agressifs.

Open Field

Les souris ont été placées dans une boîte à fond blanc de 33cm2 pendant 10 min. Une intensité lumineuse homogène (300 lux) a été mise dans la pièce. Les boîtes ont été virtuellement divisées en une région centrale et en coins. Le déplacement des souris a été suivi par vidéo. La vitesse, la distance, le temps d’immobilité, le temps passé au centre et dans les coins ainsi que le nombre d’entrées dans le centre et les coins ont été analysés via

le logiciel Any maze (Stoelting Co, Wood Dale, IL, USA). Après chaque enregistrement,

Reconnaissance d’un nouvel objet

Le premier jour de test, les souris ont chacune été placées dans une boîte à fond blanc (40

cm x 20 cm x 40 cm) sans objet, avec une lumière homogène (300 lux) pendant 10 min332.

Cette étape permet aux souris de s’acclimater à ce nouvel environnement. Elles ont été ensuite remises dans leur cage. Deux objets identiques ont été placés dans des coins distincts de la boîte, à 2 cm des bords. Les souris ont été replacées dans leur boîte respective avec un temps d’exploration des objets de 10 min. Les souris ayant examiné moins de 10 sec chaque objet ont été retirées de l’analyse. Chaque boîte fut lavée et séchée entre chaque souris. Le deuxième jour, un des deux objets a été remplacé par un nouvel objet. Les souris ont été replacées dans leur boîte respective avec un temps d’exposition de 5 min. Le nouvel objet fut de taille similaire à l’ancien. La caméra a été placée au-dessus des boîtes. Les analyses ont été effectuées grâce aux vidéos et aux données enregistrées avec le logiciel Any maze (Stoelting Co, Wood Dale, IL, USA). L’indice d’exploration a été défini par la direction du nez de souris et à une distance de moins de 2cm de l’objet. Le temps d’exploration du nouvel objet a été normalisé sur le temps d’exploration des deux objets (TN / (TF + TN) x100, avec TN = temps d’exploration du nouvel objet, TF = temps

d’exploration de l’objet familier).

Test de Barnes

La veille du test, les souris dans leur cage ont été placées dans la salle de comportement pour l’acclimatation. Durant le test les souris ont été placées sur une table circulaire

métallique (table de Barnes) contenant 20 trous à égales distances les uns des autres248. Des

repères visuels ont été placés dans la pièce (boîte, table) et sont restés aux mêmes emplacements durant tout le test de Barnes. Les souris sont restées dans cette pièce durant tous les jours de test. Une lumière de 800 lux et un bruit strident de 74 décibels ont été utilisés pour favoriser la fuite de la souris dans la plateforme de sortie. La table ainsi que la plateforme ont été nettoyées et séchées entre chaque souris.

Pour la phase d’habituation, un seul des trous présentait une plateforme de sortie en dessous, permettant à la souris de s’y cacher. Le premier jour du test, chaque souris a été placée dans la plateforme de sortie pendant 1 min afin qu’elle s’y familiarise (uniquement à jour 1). Puis durant 4 jours, chaque souris fut placée au centre de la table avec un temps

d’exploration de 3 min ou jusqu’à leur entrée dans la plateforme de sortie. Chaque test a été effectué trois fois par jour par intervalles de 30 min. La plateforme de sortie est restée à la même place durant les 4 jours de test.

Pour la phase de rappel (jour 5 et 12), la plateforme de sortie a été retirée et les souris ont eu 3 min pour explorer la table.

La table fut séparée virtuellement en 4 quadrants, quadrant avec la plateforme de sortie (C, cachette), quadrant Ouest (O), quadrant Est (E) et quadrant Sud (S). La vitesse, la distance, le temps d’immobilité, le temps passé dans chaque quadrant, le temps primaire et le temps total ont été mesurés via Any maze (Stoelting Co, Wood Dale, IL, USA). Le nombre d’erreurs primaires et totales a été compté manuellement.

Immunohistochimie

Les souris ont été décapitées à froid. Un demi-hémisphères de chaque souris a été placé dans une solution de Bouin pendant 24 heures, puis dans du sucrose 30% pendant encore 24 heures avant d’être stocké à -80°C. Les coupes au cryostat ont été effectuées à une épaisseur de 20 µm en frontal puis conservées dans une solution antigel avant d’être utilisées pour l’immunohistochimie en coupes flottantes. Les coupes ont été mises dans du tampon d’acide citrique (citrate de sodium à 0,1M et 10% d’éthanol, pH = 8,5) pendant 40 min à 70°C, puis laisser refroidir à température pièce pendant 30 min. Elles ont ensuite été placées dans du peroxyde d’hydrogène pendant 30 min puis dans du borohydrure de sodium 0,1% pendant encore 30 min. Enfin, les coupes ont été mises dans une solution de blocage (sérum de bovin nouveau-né 9%, de BSA 1% et de 0,5% de Triton 100X) pendant 1h à température pièce. Finalement, elles sont restées à 4°C pendant une nuit dans du tampon de blocage avec des anticorps primaires : Iba1 (1 : 500, #019-19741, Wako), NeuN (1 : 500, MAB377, Millipore), MAP2 (1 : 500, AB5622, Millipore) ou GFAP (1 : 500, clone SMI22, #835301, BioLegend). Le lendemain, les coupes sont restées 2h à température pièce dans de tampon contenant l’anticorps primaire avant d’être rincées puis mises dans du PBS (Phosphate-buffered Saline) 1X contenant des anticorps secondaires (Alexa fluor 568 anti-souris #1736975, anti-lapin #1832035 et Alexa Fluor 488 anti-lapin #A11034, anti-souris #A11029) pendant 1h30 à température pièce. Le Dapi, marqueur nucléaire, (D3571, Thermofisher) a été mis pendant 7 min sur les coupes avant que celles-ci

soient mises sur lame dans une solution aqueuse de Fluoromount (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific ; #00-4958-02). Les coupes ont ensuite été observées au microscope à fluorescence (Zeiss AxioImager, zoom 10X/20X), les images ont ensuite été analysées avec le logiciel ZEN (ZEN 2012 SP2 Software, Zeiss).

ELISA

Le niveau d’Aβ1-40 et d’Aβ1-42 murin soluble a été dosé à partir des protéines extraites de l’hippocampe et du cortex frontal. Le dosage ELISA (Life technologies, cat n° PP0812) a été effectué en suivant les instructions du fournisseur. Les valeurs ont ensuite été normalisées sur la quantité de protéines totales des échantillons.

Culture cellulaire et transfection

Les cellules immortalisées embryonnaires humaines de reins (HEK, human embryonic

kindey, en anglais) et hippocampales de souris (HT22) ont été maintenues en culture dans

du DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) complémenté avec 10% de sérum de bovin nouveau-né et des antibiotiques (pénicillines et streptomycines). Les cellules ont été mises en plaque de 6 puits (300 000 cellules/ml) et transfectées lorsque la confluence a atteint 60%. Les plasmides ont été transfectés avec de la lipofectamine en suivant les instructions des manufacturiers (Invitrogen P/N52887). Les protéines/ARNs ont été extraits 48h après transfection.

Extraction de protéines et d’ARN

Les protéines totales ont été extraites en utilisant un tampon RIPA ( (50 mM tris-HCL à pH 7.4, 150 mM NaCl et 1mM EDTA) auquel ont été ajoutés des inhibiteurs de phosphatases (1mM du sodium d’orthovanadate activée, 1 mM du sodium fluoride), 1mM de phenylmethylsulfonyl fluoride, un cocktail d’anti-protéases dépourvu d’EDTA, en tablette (Roche life science), Triton 100X et 0.5% sodium-déoxycholate (Sigma, cat n°D6750). Le lysat obtenu fut centrifugé pendant 20 min à 35000 g à 4°C. Le surnageant fut récupéré, 15- 20 µg de protéines ont été mélangées à du tampon de NuPAGE® LDS (Life technologies) et 5% de β-mercaptoéthanol pour de l’immunobuvardage.

les instructions de la compagnie.

Polymérase quantitative en chaîne en temps réel (qPCR)

La quantification du niveau de miR dans les échantillons a été effectuée grâce au kit de TaqMan « miR Reverse Transcription » (Applied Biosystem, Burlingtom, Canada) et le mix « TaqMan Universal Master » (Applied Biosystem, cat n°4324018) en suivant le protocole fourni par la compagnie. Les amorces utilisées proviennent de Thermo Fisher

(miR-138 ID: 000594; RNU48 ID : 001006). Le niveau des miRs a été normalisé sur le

miR de référence RNU48, puis analysé selon la méthode comparative Ct (2-ΔΔCt). Le

programme pour la transcription inverse était de 30 min à 16°C puis 30 min à 42°C suivi de 5 min à 85°C. Le programme pour la qPCR était de 2 min à 50°C, 20 sec à 95°C et 40 cycles de 3 sec à 95°C suivi de 30 sec à 60°C.

Immunobuvardage

Vingt microgrammes de protéines ont été séparés par migration sur gel « stain-free » TGX fait d’acrylamide 10% (Bio-Rad TGX stain-free FastCast Acrylamide kit 10%) puis transférés sur une membrane de nitrocellulose de 0,45 µm (Bio-Rad, Mississauga, Canada). Ces membranes ont ensuite été bloquées dans une solution de lait 5% et BSA 1% (Bovine Serum Albumin, Bioshop, ALB007-500) puis incubées à 4°C toute une nuit avec des anticorps primaires : Synaptophysine (1 : 1000, MAB5258-20UG, clone SY38, Millipore), PSD95 (1 : 1000, #2507, Cell signaling), NeuN (1 : 1000, MAB377, Millipore), Iba1 (1 : 1000, #019-19741, Wako), GFAP (1 : 1000, clone SMI22, #835301, BioLegend), Bace1

(1 : 1000, D10E5, #5606S, Cell Signaling),Kindlin2 (1 : 1000, ab74030, Abcam),APP (1 :

1000, 6E10, sig-39320, Covance), GSK-3β (1: 1000, 3D10, #9832, Cell Signaling), Tau

total (1 : 40 000, #A0024, Dako,), BDNF (1 : 1000, N-20, sc-546, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), Tau PHF1 (1 : 1000, donné Peter Davies). Le lendemain, les membranes ont été placées dans une solution d’anticorps secondaires anti-IgG-HRP (1 : 5000, anti-souris #115-035-146, anti-lapin #111-035-144, Jackson ImmunoResearch) à température pièce pendant 1h. Les bandes révélées ont été obtenues grâce à une solution de révélation de la technologie « Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate » (#WBKLS00500, Millipore) et visualisées avec l’appareil and Fusion FX (Vilber Lourmat,

Eberhardzell, Germany). L’intensité des bandes a été normalisée sur la quantité de protéines totales obtenues en suivant les instructions de la compagnie Bio-Rad. L’intensité des bandes a ensuite été quantifiée en utilisant le logiciel ImageJ NIH.

Analyses statistiques

Toutes les analyses statistiques ont été effectuées en utilisant le logiciel GraphPad Prism 7 (Graph Pad Software, Inc, La Jolla, California, USA). Différents tests statistiques ont été réalisés : test-T de student pairé ou Two-Way Anova. Une valeur p < 0,05 fut considérée comme statistiquement significative.