Material y Métodos
3. Material y métodos
3.4. Métodos de tratamiento de muestras
3.4.2. Tratamiento de muestras para análisis de propóleos
El tratamiento de muestras de propóleos para su análisis al microscopio óptico está en basado en Barth (1998). Se presentan dos opciones de tratamiento, con y sin acetólisis. Como ya se ha comentado en el apartado de mieles, usar acetólisis permite estudiar mejor las características de los granos de polen, pero destruye una parte muy importante de esporas. De ahí que un estudio completo incluya los dos tipos de tratamiento. Los pasos 1-10 son comunes entre los dos tratamientos, a partir del paso 11, se utiliza una submuestra (división de la muestra principal que se realiza en el paso 3) para el tratamiento sin acetólisis y otra para el que es con acetólisis.
3.4.2.1. Protocolo para análisis de propóleos (sin acetólisis)
Material y Métodos
Cardellach Lliso, Pau 82
1. Triturar la muestra de propóleo.
2. Tomar 0,5 gr. de propóleo triturado y disolverlo en 15 mL de etanol (96º). Dejar entre 12 y 24h, removiendo de vez en cuando.
3. Repartir la muestra entre dos tubos de centrífuga.
4. Centrifugar a 2500 rpm durante 10 minutos y decantar.
5. Añadir a cada tubo 13 mL de etanol (96º).
6. Centrifugar a 2500 rpm durante 10 minutos y decantar.
7. Añadir 12 mL de KOH 10%(1) y poner al baño maría a 60ºC durante 10 minutos removiendo de vez en cuando con una varilla de vidrio (si se dispone de agitador de ultrasonido, 5 min de agitación serán suficientes).
8. Centrifugar a 2500 rpm durante 10 minutos y decantar.
9. Añadir 13 mL de H2O destilada, resuspender las muestras, y transferir el sedimento a otro tubo de centrífuga, filtrando a través de una malla de fibra de plástico de 0,3 mm para eliminar las partículas orgánicas más gruesas.
10. Centrifugar a 2500 rpm durante 10 minutos y decantar.
Preparación de la lámina para análisis de esporas y restos biológicos
11. En uno de los duplicados añadir 60 µL de agua destilada y re-suspender el sedimento de la muestra utilizando la misma punta de la pipeta usada para pipetear el agua.
12. Recuperar con la misma punta de pipeta 30 µL y colocar la mitad del contenido sobre un cubreobjetos de 20x20 situado sobre la placa calefactora a 37ºC (Nota: en el momento de colocar la muestra, el cubreobjetos ha de estar a 37ºC). Antes de que se evapore todo el líquido de la muestra, añadir la mitad restante. Esperar a que se evapore el líquido.
13. Misma operación para los 30 µL restantes encima de la muestra del mismo cubreobjetos. (Nota: en caso de que la muestra sea muy densa, esta segunda operación se hará en el mismo portaobjetos pero en un cubreobjetos diferente).
14. Una vez se dispone del sedimento seco encima del cubreobjetos, aún sobre la placa calefactora a 37ºC, se añaden 20 µL Dietil Éter (para eliminar la capa lipídica de la superficie (Gong et al., 2015)) y se deja evaporar.
15. Sobre un portaobjetos se añaden a continuación 20 µL aproximadamente de glicerogelatina(2) (previamente calentada para llevarla a estado viscoso).
Análisis esporo-polínico de la miel y el propóleo, y su relación con el entorno
Cardellach Lliso, Pau 83 16. Se toma el cubreobjetos con la muestra de propóleo, se le da la vuelta y se coloca sobre el portaobjetos, en contacto con la glicerogelatina, intentando que no se formen burbujas de aire.
17. Cuando la glicerogelatina se solidifica, se sellan los bordes del cubreobjetos con histolaca (LMR®).
3.4.2.1. Protocolo para análisis de propóleos (con acetólisis)
Los pasos 1 a 10 coinciden enteramente con los citados anteriormente. De hecho, esta preparación se hace con el duplicado de la muestra obtenido en el apartado 3.4.2.1.
11. Añadir 5 mL de ácido acético glacial (AcOH glacial) y dejarlo actuar durante un mínimo de 3 horas.
12. Centrifugar a 2500 rpm durante 10 minutos y decantar.
13. Añadir la mezcla acetolítica (9 partes de anhídrido acético y 1 parte de ácido sulfúrico concentrado) y poner al baño maría a 80ºC, de 3 a 10 minutos
14. Añadir 5 mL de ácido acético glacial para parar la acetólisis.
15. Centrifugar a 2500 rpm durante 10 minutos y decantar,
16. Añadir 15mL de agua destilada, centrifugar a 2500 rpm durante 10 minutos y decantar.
Preparación de la lámina para análisis polínico
Las láminas para observación al microscopio óptico se han preparado, como en el caso de las mieles, sigueindo dos protocolos diferentes, en función de querer confeccionar una lámina con los elementos estáticos (preparación con glicerogelatina) o con posibilidad de hacer girar el polen sobre su eje (preparación con glicerina).
a) Preparación con glicerogelatina para contaje de polen.
17. Añadir 60 µL de agua destilada y re-suspender la muestra utilizando la propia punta de la pipeta.
18. Recuperar 30 µL y colocar la mitad del contenido sobre un cubreobjetos de 20x20 situado sobre la placa calefactora a 37ºC. Antes de que se evaporetodo el líquido de la muestra añadir la mitad restante. Esperar a que se evapore el líquido.
(Nota: en el momento de colocar la muestra, el cubreobjetos ha de estar a 37ºC)
Material y Métodos
Cardellach Lliso, Pau 84
19. Misma operación para los 30 µL restantes encima de la muestra del mismo cubreobjetos.
(Nota: en caso de que la muestra sea muy densa, esta segunda operación se hará en el mismo portaobjetos, pero en un cubreobjetos diferente).
20. Una vez se dispone del sedimento seco encima del cubreobjetos, aún sobre la placa calefactora a 37ºC, se añaden 20 µL de Dietil Éter (para eliminar la capa lipídica de la superficie (Gong et al., 2015)) y se deja evaporar.
21. Sobre el portaobjetos de 20x20se añade 20 µL aproximadamente de Glicerogelatina(2) (previamente calentada).
22. Sobre un portaobjetos se añaden a continuación 20 µL aproximadamente de glicerogelatina con fucsina(2) (previamente calentada para llevarla a estado viscoso) 23. Cuando la glicerogelatina se solidifica, se sellan los bordes del cubreobjetos con
histolaca (LMR®).
b) Preparación con glicerina. En caso de hacer preparaciones con el contenido móvil para observar mejor algunas características de granos de polen no identificados hay que realizar esta preparación como continuación del punto 16.
17. Resuspender el sedimento en agua glicerinada 30%(3) y añadir 2 gotas de solución de fucsina (4). Remover y dejar reposar 20 min.
18. Centrifugar, decantar, poner el tubo boca abajo y dejar durante mínimo 2 horas, hasta que se seque el sedimento.
19. Añadir 60 µL de glicerina fenolada al 1%(5), resuspender el sedimento y homogeneizar.
20. Recoger 60 µL de la muestra y colocarlos en un portaobjetos, extendiendo con cuidado la muestra evitando que se formen burbujas de aire.
21. Antes de cubrir la muestra con un cubreobjetos de 20x60, en los laterales más largos del cubreobjetos se ha aplicado una línea continua de histolaca (LMR®) y se ha dejado secar. Una vez la histolaca está seca, se aplica una nueva capa sobre las mismas líneas y, sin dejar que se seque, se da la vuelta al cubreobjetos y se coloca sobre el portaobjetos con la muestra extendida, cuidando que no se formen burbujas de aire. Se presionan suavemente los bordes largos del cubreobjetos, haciendo que se extienda la muestra y no haya burbujas de aire. Finalmente, se sellan los laterales estrechos del cubreobjetos con histolaca (LMR®).
(Nota: estas muestras se han de almacenar en horizontal).
Análisis esporo-polínico de la miel y el propóleo, y su relación con el entorno
- Pesar 7 gr de Gelatina plata 80-100 bloomy añadir 42 mL de H2O destilada, homogeneizar y dejar reposar durante 2 horas.
- Añadir 50 mL de glicerina 99% (AGR) y 1 gr. de fenol. Homogeneizar al baño maría.
- Añadir 0.05 mg de fucsina y homogeneizar.
- Dejar reposar y enfriar.
(3) Agua glicerinada 30%
- Poner 200 mL de glicerina pura en un vaso de precipitado de 1000 mL.
- Añadir 100 mL de glicerina fenolada 25%(6). - Añadir H2O destilada hasta completar 1000 mL.
Almacenar la solución dentro de una botella y agitar para que se diluya la glicerina.
(4) Solución de fucsina: Poner 5mg de fucsina en 100 mL de H2O destilada.
(5) Glicerina fenolada 1%
- Poner 100 mL de glicerina fenolada al 25% en un vaso de precipitado de 1000 mL.
- Añadir glicerina pura hasta completar 1000 mL.
(6) Glicerina fenolada 25%
- Como el fenol es un sólido cristalizado a temperatura ambiente, se tiene que poner al baño maría para tenerlo en estado líquido.
Atención: debido a que el fenol es muy tóxico se tiene que trabajar bajo una campana extractora y tener la precaución de aflojar la botella de fenol antes del baño maría.
- Tomar 250 mL de fenol en una probeta.
- Añadir 500 mL de glicerina pura en un vaso de precipitado de 1000 mL y calentar hasta 40-50ºC
- Adicionar el fenol a la glicerina agitando continuamente para evitar que recristalice.
- Una vez disuelto, añadir 250 mL de glicerina pura y homogeneizar.