Material y Métodos
3. Material y métodos
3.4. Métodos de tratamiento de muestras
3.4.1. Tratamiento de muestras para análisis de mieles
El tratamiento de las muestras de mieles se realizó utilizando dos protocolos, uno sin acetólisis, para la identificación y cuantificación de los granos de polen en muestras sin o con muy pocos pólenes indeterminados, y otro con acetólisis, para la identificación y cuantificación de granos de polen en muestras con elevado número de indeterminados.
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3.4.1.1. Protocolo para análisis de mieles sin acetólisis
El protocolo de análisis de mieles sin acetolizar está basado en Yang et al. (2012) consensuado con la Dra. Marie-José Battesti (Université Pascal Paoli. Corsica. France) y adaptado al funcionamiento y recursos del Laboratori d’Anàlisis Palinològiques-UAB.
1. Pesar 10 g de la muestra de miel en un vaso de precipitados de 100 mL., añadir 40 mL de agua acidulada (1) (facilita la solubilización de sales insolubles en agua como el oxalato cálcico, así como de sustancias coloidales que pueda haber en la miel).
2. Agitar 20 minutos a 20-25ºC, en agitador mecánico con micro–imán, a 250 rpm, para disolver los azúcares de la miel.
3. Repartir equitativamente la muestra en 4 tubos de centrífuga (base cónica) retirando previamente el imán (sin tocarlo) con otro imán.
4. Centrifugar las muestras a 2500 rpm durante 10 minutos y decantar.
5. Añadir 5mL de agua destilada a cada tubo y re-suspender la muestra utilizando un agitador Vortex hasta que se homogenice.
6. Reunir el contenido de 3 de los tubos en el cuarto, obteniendo así un volumen acumulado entorno a 20mL.
7. Centrifugar a 2500 rpm durante 10 minutos y decantar.
8. Añadir 40 µL de agua destilada y re-suspender el sedimento de la muestra.
Preparación de la lámina para análisis esporo-polínico
9. Recuperar 20 µL y colocar la mitad del contenido sobre un cubreobjetos de 20x20 situado sobre la placa calefactora a 37ºC. Antes de que se evapore todo el líquido de la muestra, añadir la mitad restante. Esperar a que se evapore el líquido.
(Nota: en el momento de colocar la muestra, el cubreobjetos ha de estar a 37ºC).
10. Misma operación para los 20 µL restantes encima de la muestra del mismo cubreobjetos.
(Nota: en caso de que la muestra sea muy densa esta segunda operación se hará en el mismo portaobjetos, pero en un cubreobjetos diferente).
Análisis esporo-polínico de la miel y el propóleo, y su relación con el entorno
Cardellach Lliso, Pau 79 11. Una vez se dispone del sedimento seco encima del cubreobjetos, aún sobre la placa calefactora a 37ºC, se añaden 20 µL de Dietil Éter (para eliminar la capa lipídica de la superficie (Gong et al., 2015)) y se deja evaporar.
12. Sobre un portaobjetos se añaden a continuación 20 µL aproximadamente de glicerogelatina con fucsina(2) (previamente calentada para llevarla a estado viscoso) .
13. Se toma el cubreobjetos con la muestra de miel, se le da la vuelta y se coloca sobre el portaobjetos, en contacto con la glicerogelatina, intentando que no se formen burbujas de aire.
14. Cuando la glicerogelatina se solidifica, se sellan los bordes del cubreobjetos con histolaca (LMR®).
(1) Agua acidulada (ácido sulfúrico al 5%).
- Pesar 5 g de H2SO4 al 96%.
- Poner 500 mL de H2O destilada en un vaso de precipitados; adicionar lentamente el H2SO4
removiendo continuamente.
- Dejar enfriar.
- Transvasar a un matraz y añadir H2O destilada hasta completar un 1L.
(2) Glicerogelatina con fucsina
- Pesar 7 gr de Gelatina plata 80-100 bloom y añadir 42 mL de H2O destilada, homogeneizar y dejar reposar durante 2 horas.
- Añadir 50 mL de glicerina 99% (AGR) y 1 gr. de fenol. Homogeneizar al baño maría (50ºC).
- Añadir 0.05 mg de fucsina básica y homogeneizar.
- Dejar reposar y enfriar.
3.4.1.2. Protocolo para análisis de mieles con acetólisis
La preparación de las muestras de miel incorporando acetólisis en el proceso permite observar mejor las estructuras de la exina de los granos de polen. Además, usando este protocolo, el contenido polínico del sedimento se mantiene en un medio viscoso del que se toma una muestra homogénea y se traslada a un portaobjetos. Antes de añadir el cubreobjetos se le ha hecho una marca previa con histolaca (LMR®) alrededor que va a dejar un cierto grosor de gliceratina con el sedimento polínico entre portaobjetos y cubreobjetos. Ello permite hacer girar a los granos de polen sobre su eje y observarlos desde todos los ángulos posibles. Como contrapartida, la acetólisis elimina muchas esporas de hongos, levaduras y algas que pueda contener la miel, por eso no se recomienda este método para realizar el
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contaje, solo para identificar. Este método está basado en el protocolo del Laboratori d’Anàlisis Palinològiques-UAB para muestras de mieles (Torreguitart, 1986).
1-7. Los pasos 1 a 7 coinciden enteramente con los citados anteriormente.
8. Añadir 5 mL de ácido acético glacial (AcOH glacial) y dejarlo actuar durante mínimo 3 horas.
9. Centrifugar a 2500 rpm durante 10 minutos y decantar
10. Añadir la mezcla acetolítica (2) y poner al baño maría, a 80ºC, de 3 a 10 minutos.
11. Añadir 5 mL de ácido acético glacial para parar la acetólisis.
12. Centrifugar a 2500 rpm durante 10 minutos y decantar.
13. Añadir 5mL de agua destilada, centrifugar a 2500 rpm durante 10 minutos y decantar.
Preparación de la lámina para análisis esporo-polínico
14. Resuspender el sedimento en agua glicerinada 30%(3) y añadir 2 gotas de solución de fucsina (4). Remover y dejar reposar 20 min.
15. Centrifugar, decantar, poner el tubo boca abajo y dejar durante mínimo 2 horas, hasta que se seque el sedimento.
16. Añadir 60 µL de glicerina fenolada al 1%(5), resuspender el sedimento y homogeneizar.
17. Recoger 60 µL de la muestra y colocarlos en un portaobjetos, extendiendo con cuidado la muestra evitando que se formen burbujas de aire.
18. Antes de cubrir la muestra con un cubreobjetos de 20x60, en los laterales más largos del cubreobjetos se ha aplicado una línea continua de histolaca (LMR®) y se ha dejado secar. Una vez la histolaca está seca, se aplica una nueva capa sobre las mismas líneas y, sin dejar que se seque, se da la vuelta al cubreobjetos y se coloca sobre el portaobjetos con la muestra extendida, cuidando que no se formen burbujas de aire. Se presionan suavemente los bordes largos del cubreobjetos, haciendo que se extienda la muestra y no haya burbujas de aire. Finalmente, se sellan los laterales estrechos del cubreobjetos con histolaca (LMR®).
(Nota: estas muestras se han de almacenar en horizontal).
Análisis esporo-polínico de la miel y el propóleo, y su relación con el entorno
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(1) Agua acidulada (ácido sulfúrico al 5%).
- Pesar 5 g de H2SO4 al 96%.
- Poner 500 mL de H2O destilada en un vaso de precipitados; adicionar lentamente el H2SO4
removiendo continuamente.
- Dejar enfriar.
- Transvasar a un matraz y añadir H2O destiladahasta completar un 1L.
(2) Mezcla acetolítica
Nota: la mezcla debe prepararse al momento. Es obligatorio utilizar guantes y gafas para preparar esta solución y seguir estrictamente el procedimiento indicado.
- En un vaso de precipitados de 50 mL añadir 9 mL de anhídrido acético (C4H6O3) y añadir muy lentamente y removiendo suavemente 1mL de H2SO4. Con esta cantidad hay solución suficiente para dos muestras (5 mL por muestra).
- Si la solución presenta una tonalidad amarilla, se tiene que desechar puesto que significaría que las proporciones no se han respetado).
(3) Agua glicerinada 30%
- Poner 200 mL de glicerina pura en un vaso de precipitados de 1000 mL.
- Añadir 100 mL de glicerina fenolada 25%(6). - Añadir H2O destilada hasta completar 1L.
Almacenar la solución dentro de una botella y agitar para que se diluya la glicerina.
(4) Solución de fucsina: Poner 5mg de fucsina básica en 100 mL de H2O destilada.
(5) Glicerina fenolada 1%
- Poner 100 mL de glicerina fenolada al 25% en un vaso de precipitados de 1000 mL.
- Añadir glicerina pura hasta completar 1L.
(6) Glicerina fenolada 25%
- Como el fenol, a temperatura ambiente, es un sólido cristalizado se tiene que poner al baño maría para tenerlo en estado líquido.
Atención: debido a que el fenol es muy tóxico se tiene que trabajar bajo campana extractora y tener la precaución de aflojar el tapón de la botella de fenol antes de ponerla al baño maría.
- Poner 500 mL de glicerina pura en un vaso de precipitados de 1000 mL y calentar hasta 40-50ºC.
- Adicionar 250 mL de fenol en estado líquido, removiendo continuamente para evitar que recristalice.
- Una vez disuelto, añadir 250 mL de glicerina pura y homogeneizar.