Le traitement du signal SPRi

La chimie de surface des capteurs SPRi utilisée pour l’immobilisation de ligand (monocouche exposant des groupements acide carboxylique permettant une immobilisation de ligand par greffage EDC/NHS) semble avantageuse pour la réalisation de tests SPRi quantitatifs et particulièrement dans le cas d’analyte de très haut poids moléculaire tel que des particules virales (PM ~ 10⁶ Da) (149,197). Cependant, l’absence de matrice tridimensionnelle en surface du capteur (exemple : matrice de Dextran) ne permet pas de limiter les interactions non-spécifiques entre les contaminants éventuels du surnageant de culture et la surface du biocapteur. Nous avons initialement cherché à évaluer le signal non-spécifique potentiellement induit par les composants du milieu de culture (voir Figure 63). Nous avons pu observer que certains milieux (SFM4TransFx) entrainaient un signal non spécifique élevé, probablement dû à la présence de composés de nature protéique dans leur composition. Par ailleurs, nous avons validé que le milieu utilisé pour les infections en culture MDCK (EMEM) n’entrainait pas de signal non-spécifique.

0 50 100 150 200 250 300 350

116

Figure 63 : Réponse obtenue (double référencement) lors de l’analyse de différents tampons/milieux de culture.

VI.5.2. Référencement des sensorgrames et détermination du kt

Afin de valider que les sensorgrames obtenus indiquaient des conditions de limitation par le transfert de masse, un triple référencement de la réponse a été réalisé lors de l’analyse des productions virales réalisées en culture MDCK (voir Figure 64) :

 1° référencement : pour chacune des surfaces (mesure et référence), soustraction du signal obtenu pour la surface par le signal d’une aire d’intérêt au niveau de laquelle circule uniquement le tampon.

 2° référencement : soustraction du signal SPRi de la surface de mesure (fétuine) par le signal SPRi de la surface de référence (fétuine dé-sialylée).

 3° référencement : soustraction du signal SPRi obtenu lors de l’analyse de productions virales en cellules MDCK par le signal obtenu lors de l’analyse de surnageant de culture non-infectée (« mock ») prélevé au même temps de culture.

D’après la Figure 64A, on observe la présence d’un signal non-spécifique durant la phase d’association lors de l’analyse de surnageants de culture non infectée. Cependant le signal non-spécifique est quasi-nul lors de la phase de dissociation (voir Figure 63. Le profil des sensorgrames obtenus après triple référencement (Figure 64C) nous a permis de valider que l’analyse de particules virales par SPRi, dans les conditions évaluées entrainait un signal indiquant une limitation par le transfert de masse : le signal est linéaire (sans épaulement) durant toute la durée de la phase d’association évaluée (Δtass = 360s). Ces observations sont en accord avec d’autres publications qui évaluent que l’état d’équilibre lors de l’analyse de l’interaction de particules virales entières avec des surfaces présentant des glycanes est atteint pour une durée

PBS EMEM Ultra-MDCK Optipro SFM4TransFX 0

50 100 150

Réponse SPRi [RU]

117

de l’ordre de grandeur de ~1h (et pour des concentrations en particules virales de l’ordre de 10⁹ particule.mL^-1) (168,172). Le profil des sensorgrames est également similaire à celui d’autres tests SPR quantitatifs précédemment développés (197,200,201).

Figure 64 : Triple référencement du signal SPRi pour l’évaluation des interactions spécifiques entre les particules virales d’Influenza et les surfaces présentant des glycanes avec des extrémités terminales acides sialiques. A/

Sensorgrames obtenus (1° référencement) lors de l’analyse d’échantillons de surnageant de culture MDCK infectée (trait plein) ou non (Mock, pointillé) à 48 h.p.i. (OC 10 µM, débit = 5µL/min, tampon PBS-T 0,005% v/v, 15°C) B/ Sensorgrames obtenus après double référencement des analyses SPRi par soustraction des signaux Fc2-Fc1 C/ Sensorgrame obtenu après triple référencement D/Cellule fluidique avec les aires d’intérêt utilisées pour le premier référencement pour les surfaces de référence (gris) et de mesure (rouge)

Ces conditions permettent d’évaluer la réponse SPRi obtenue par la détermination du taux d’association initiale par régression linéaire sur la partie initiale (30s) ou sur toute la durée de la phase d’association avec des coefficients de régression R² > 0,99. Par ailleurs, puisque le virus ne présente pas de dissociation mesurable dans l’intervalle de temps de la phase de dissociation (180s) et que la réponse non-spécifique évaluée durant la phase de dissociation pour des échantillons de surnageant de culture cellulaire non infectée est quasi-nulle, il est ici possible d’évaluer un taux d’association initiale selon la formule :

𝑑𝑅

𝑑𝑡 ~ = 𝑅

Δ𝑡 (é𝑞𝑢𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 6.1)

Avec Rdiss la réponse « finale » évaluée lors de la phase de dissociation. Nous avons pu valider cette observation en évaluant la réponse SPRi suivant les deux méthodes après triple

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référencement des sensorgrames (voir Figure 65). Ainsi, dans le cas où le surnageant de culture n’entraine pas de signal non-spécifique élevé, il est possible d’évaluer le taux d’association initiale directement selon l’équation 6.1 sans réaliser de triple référencement.

Figure 65 : A/ Corrélation entre le taux d’association initiale évalué directement sur les sensorgrames référencés et le taux calculé par l’équation 6.1 B/Courbes de calibration obtenues pour l’analyse de virus Influenza (A/X-179A

– MDCK) à différents débits.

Afin de valider d’avantage que l’analyse de particules virales entières entrainait une limitation par le transfert de masse importante, des gammes de calibrations ont été réalisées à deux débits différents (Q=5 et 30 µL.min^-1). Nous avons ainsi pu évaluer un coefficient de transfert de masse kt pour les deux débits (kt correspond aux pentes des droites de calibration de la Figure 65B, détaillées dans le Tableau 27). Ceci a permis de valider la relation 𝑘 ~ 𝑄 ^/ issue de la résolution analytique du coefficient de transfert de masse pour les biocapteurs surfaciques tels que ceux basés sur la SPR (voir Chapitre III) (195). En effet, d’après les kt évalués pour les deux débits on obtient : Taux d'association dR/dt [RU.s-1 ] H1N1 VIRUS (5 µL.min^-1)

H1N1 VIRUS (30 µL.min^-1)

A. B.

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La validation de cette égalité de ratios indique l’obtention de conditions de limitation totale par le transfert de masse tel que décrit par Pol et al. (197), ce qui induit une proportionnalité directe entre la concentration en particules virales totales actives en solution et le taux d’association initiale :

~ = 𝑘 𝐴 (é𝑞𝑢𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 6.3) (nb : en l’absence de limitation, on aurait

= 1^).

VI.6. Les performances analytiques