Ligands et méthodes d’immobilisation

V.5.1. Fonctionnalisation des puces SPRi sur l’appareil SPR-2

L’appareil SPR-2 permet la fonctionnalisation en flux de la surface des capteurs utilisés. La Figure 47 présente le protocole suivi pour la fonctionnalisation des puces SPRi.

Figure 47 : Séquence de fonctionnalisation en flux des puces SPR-2. EDC/NHS : 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide / N-hydroxysuccinimide (EDC/NHS, 0,2/0,05 M) ; NA : neuraminidase bactérienne de C. perfringens

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

Réponse [RU]

Temps [s]

Fc_1 Fc_2

EDC/NHS Fétuine (200µg/mL pH=4,5) Ethanolamine

-HCl (1M)

SDS 0,25%

NA (2,5 U/mL)

SDS 0,25%

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L’immobilisation des protéines est réalisée par greffage covalent sur une surface pré-fonctionnalisée avec des groupements acides carboxyliques. Les protéines ont été utilisées à une concentration de 200 µg/mL dans une solution tampon d’acétate de sodium 10 mM (pH = 4,5).

L’activation des groupements acide carboxylique de la surface du capteur est réalisée par une solution d’EDC/NHS : 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide/N-hydroxysuccinimide (EDC/NHS, 0,2/0,05 M, 100 µL, 25 µL/min). Par la suite, une solution de fétuine est injectée de façon unique ou répétée sur les deux surfaces afin obtenir une densité surfacique immobilisée élevée. Les groupements acides carboxyliques activés par EDC/NHS n’ayant pas réagi sont désactivés par l’injection d’une solution d’éthanolamine-HCl (1 M, pH=8,5, 25 µL/min, 4 min).

La solution de régénération (SDS 0,25%, 25 µL/min, 1 min) est ensuite injectée sur les deux surfaces pour désorber les protéines non greffées. Puis une solution de neuraminidase bactérienne (neuraminidase bactérienne de C. perfringens, 2,5 U/mL, 100µL, 25µL/min) est injectée sur la surface contrôle afin d’obtenir une lyse des acides sialiques terminaux des glycanes exposés par les protéines de fétuine immobilisées. L’inactivation totale de la surface par les conditions de lyse enzymatique décrites a été par la suite validée lors du passage de solutions de vaccin influenza (voir Chapitre VI).

Figure 48 : Traitement de la surface de référence du capteur SPRi fonctionnalisé par la neuraminidase bactérienne de C. perfringens (2,5 U/mL) A/Surface de référence (gris) et surface de détection (rouge) B/Variation du signal SPRi (ΔRU) obtenue lors de l’injection de solution de neuraminidase bactérienne sur la surface de référence (Fc_2)

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V.5.2. Immobilisation de ligands sur biopuce SPR multiplexée V.5.2.1. Automate de dépôt

Le dépôt de solutions de fétuine, BSA, de glycanes (voir Tableau 17) et d’anticorps (voir Tableau 18) sur les prismes SPRi a été réalisé à l’aide d’un automate de dépôt (Scienion Sciflexarrayer S3) basé sur le dépôt en mode « sans contact » de gouttes de volume de l’ordre de 100-300 pL par la technique de type « jet d’encre » actionné par effet piézoélectrique. Un ajustement de la fréquence de déformation et du voltage appliqué au cristal piézoélectrique permet de régler le volume des gouttes et leur position relative au capillaire (Figure 49B).

Figure 49 : Dépôt automatisé de ligand à la surface de prismes. A/ Automate de dépôt Scienion Sciflexarrayer S3 B/ Capillaire et élément de transduction piezoélectrique (gris) permettant le dépôt à la demande de gouttes de volume définit C/ Prisme SPRi (9*9 spots) obtenu après immobilisation de glycanes par dépôt automatisé.

V.5.2.2. Traitement des prismes

Les prismes (SPRi Biochips, Horiba) ont été fonctionnalisés par formation d’une monocouche d’acide α-lipoïque (ou acide thioctique) à partir d’une solution à une concentration de 100 mM dans l’éthanol absolu anhydre par incubation pendant 10-12h à température ambiante (151).

Cela permet d’obtenir une surface présentant des groupements acides carboxyliques exploitables pour le greffage de biomolécules. Avant réutilisation, les prismes ont été traités par oxydation grâce à une solution de piranha (mélange H2O2 :H2SO4, 1:3 v/v, 2h) avant rinçage par l’eau distillée et séchage.

V.5.2.3. Stratégie de fonctionnalisation des biopuces

Différentes stratégies de fonctionnalisation ont été utilisées selon les ligands à immobiliser lors de la réalisation des biopuces multiplexées (voir Figure 50).

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Figure 50 : Stratégie de fonctionnalisation en plusieurs étapes des biopuces SPRi du système Horiba-genoptics

 Greffage covalent

Après activation de la surface par une solution de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide / N-hydroxysuccinimide (EDC/NHS, 0,2/0,05 M), les solutions contenant les protéines à greffer ont été mises en contact avec la surface afin d’obtenir un greffage covalent par formation d’une liaison amide entre les groupements acides carboxyliques de la monocouche d’acide α-lipoïque et les groupements amines primaires de la fétuine ou la BSA (voir Figure 51). Les groupements n’ayant pas réagi sont inactivés par une solution d’éthanolamine-HCl (1M, pH=8,5).

Figure 51 : Stratégie de greffage covalent par 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide/N-hydroxysuccinimide (EDC/NHS) sur monocouche d’acide α-lipoïque utilisée pour fonctionnaliser les biopuces. Protocole issu de (151).

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 Capture par affinité

Les glycanes possédant un groupement biotine et les anticorps utilisés ont été immobilisés selon une stratégie de capture par affinité. Pour les glycanes biotinylés, la surface a été fonctionnalisée par greffage de streptavidine (200 µg.mL^-1, tampon acétate 10 mM pH=4,5). Pour les anticorps, la surface a été fonctionnalisée par greffage de protéine A (protéine A recombinante, 200 µg.mL

-1, tampon acétate 10 mM pH=4,5). Des plots (« spots ») de streptavidine/protéine A ont été déposés sur les prismes par dépôt automatisé (dépôt de 20 gouttes de volume ~150 pL : volume déposé de ~3 µL). Par la suite, les prismes sont laissés à incuber (1h, 4°C, humidité saturante) afin de permettre une réhydratation des plots et donc augmenter le temps permettant la réaction de greffage des ligands afin d’obtenir une densité surfacique de ligand élevée. Les prismes sont ensuite repositionnés sous l’appareil de dépôt afin de permettre les dépôts de solutions de glycanes biotinylés ou d’anticorps sur les plots correspondants en se basant sur la même grille de coordonnées spatiales (6*7 plots, espacement : 600 µm, voir Figure 52).

Les glycanes utilisés ont été fournis par le Consortium for functional Glycomics (http://www.functionalglycomics.org/). Ils sont issus de synthèses chimiques réalisées par le Scripps Institute dans le but de produire des biopuces à glycanes (glycan microarrays). Certains glycanes (01-000 et 01-088, Tableau 17) ont également été acquis auprès de la société Glycotech (http://www.glycotech.com/).

Figure 52 : Grille de dépôt de 6*7 plots utilisée pour l’immobilisation de ligand sur les biopuces SPRi.

Les glycanes ont été dilués à la concentration Cstock (cf. Tableau 17) dans du tampon TRIS-HCl à pH=8,5 avec ajout de TWEEN-20 (C=0,005% v/v) et conservés à T=4°C. Pour le dépôt, les solutions de glycanes monovalents ont été diluées à la concentration de 500 µM et celles de glycanes multivalents à la concentration de 100 µg.mL^-1 dans le même tampon (sur la base du protocole de McBride et al. (167)). Les protéines (Fétuine et albumine de sérum bovin) ont été

600 µm 600 µm

Volume ̴ 3 µL

90

diluées à la concentration de 500 µg.mL^-1 (tampon acétate 10 mM, pH =4,5). Les solutions d’anticorps ont été diluées à la concentration de 200 µg.mL^-1 (tampon PBS). Les solutions ont par la suite été déposées sur les plots pré-fonctionnalisés de streptavidine/protéine A afin d’obtenir les biopuces multiplexées (voir Figure 50). Les prismes ont été de nouveau laissés à incuber (1h, 4°C, 100% humidité), puis placés dans un dessiccateur sur la nuit.

V.6. Analyse d’hémagglutinine et de virus Influenza par SPRi quantitative