II. 1.3.4.2. Les techniques basées sur l’affinité
III.4. Biopuces et biocapteurs utilisés pour l’analyse cinétique et quantitative d’Influenza
III.4.1. Analyse cinétique des interactions hémagglutinine-glycanes
interactions virus-hôte
Les particules virales sont des complexes protéiques macromoléculaires multimériques. En effet, qu’ils soient capsidiques ou enveloppés, les virus ont pour caractéristiques de présenter une forte densité d’une ou d’un ensemble de protéines à leur surface. Ceci est notamment le cas pour le virus influenza qui présente entre 100-1000 glycoprotéines de HA à sa surface (158). Ces protéines ou les glycanes qu’elles portent vont entrer en jeu dans de nombreuses interactions biologiques hôte-pathogène (159–161) (voir Figure 30).
Ces protéines sont donc fréquemment utilisées comme cibles thérapeutiques car elles interviennent en premier plan dans les mécanismes d’infection virale par interaction protéine-protéine ou protéine-protéine-glycane au niveau de la membrane cellulaire. Par ailleurs, les glycanes exposés à la membrane cellulaire et possédant un acide sialique en position terminale sont la cible du virus influenza pour l’initiation du mécanisme d’infection virale. Leur densité surfacique est de l’ordre de 50-200 pour 100 nm² (162).
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Figure 30 : Interactions multivalentes glycanes-protéines entre les particules virales et les récepteurs présents au niveau de la membrane cellulaire. Gauche : Interactions entre le virus Influenza et les glycoprotéines membranaires de l’hôte. Droite : Interactions entre les glycanes exposés à la surface du virus et les protéines se liants aux glycanes (GBP) présents au niveau de la membrane (Tiré de (158)).
III.4.1.2. Relation structure-activité
Concernant la relation structure-activité des interactions biologiques entre le virus influenza et les glycanes des glycoprotéines membranaires de l’hôte, une tendance a été établie depuis les premières études basées sur l’hémagglutination de particules virales :
Le virus Influenza interagit avec la membrane cellulaire par liaison HA-glycanes.
Les souches virales circulantes dans les populations humaines et aviaires s’associent de manière « préférentielle » aux glycanes présentant respectivement une extrémité terminale avec une liaison Siaα2-6Gal et Siaα2-3Gal.
Figure 31 : Evolution des technologies dédiées à l’analyse de virus influenza et basées sur l’interaction virus-glycanes.
Sources : (53,163–169)
L’affinité apparente relative de HA pour des glycanes présentant un résidu terminal de type acide sialique a été évaluée pour un large éventail de glycanes et de souches virales. Le Consortium for functionnal Glycomics a produit et évalué des micropuces à glycanes ayant permis ce criblage dans les années 2000 (Figure 31) (166). Bien que ces analyses aient appuyé
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les premières observations concernant la spécificité des souches aviaires pour les glycanes présentant une liaison terminale α-2,3 (voir Figure 32), cette technique présente de nombreux biais qui rendent une évaluation quantitative directe difficile ; par exemple l’utilisation de marquage secondaires sur rHA couplées à une étiquette poly-histidine, la lecture de fluorescence en point final, l’absence de gamme de calibration externe…(170,171). L’intérêt de ces études était l’évaluation comparative du pouvoir pathogène, de la virulence ou de la transmission de différentes souches virales observé(es) chez une espèce donnée avec l’affinité apparente de la HA de ces souches évaluée pour un panel de glycanes. De manière générale, les tests en phase solide développés à ce jour sont quasi-exclusivement basés sur des méthodes de détection en point final avec un marquage et ne permettent pas une évaluation quantitative directe (171).
Figure 32 : Evaluation de la spécificité de l’hémagglutinine pour un éventail de glycanes présentant une extrémité terminale de type acide sialique par biopuces à glycanes. Résultats obtenus pour différentes souches : souche pandémique humaine (A/South Carolina/1/1918) et souche aviaire (A/Duck/Ukraine/1/1963). Tiré de (142).
Les interactions biologiques entre des protéines et des glycanes sont ubiquitaires et fréquemment retrouvées au niveau des interactions hôte-pathogène. Cependant, l’affinité d’une interaction monovalente entre les glycanes et les protéines est en général relativement faible (KD de l’ordre du mM). Des interactions multivalentes sont souvent nécessaires afin d’induire une réponse biologique (162). Pour le virus influenza, les rares données quantitatives recueillies sur l’évaluation de l’interaction monovalente glycane-HA (qui ont été réalisées sur du virus entier en phase liquide) sont détaillées dans le Tableau 12. À ce degré de valence, on observe un KD
de l’ordre du mM et une absence de spécificité de la HA pour la liaison α-2,3 ou α -2,6.
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Tableau 12 : Constantes de dissociation de complexe HA – Sialyl-N-acétyllactosamine (SLN) avec une liaison terminale α 2,3- ou α 2,6- évaluées en solution par différentes méthodes (RMN, dosage SPR indirect)
Virus Ligand Constante de dissociation KD
(Interaction monovalente)
Les derniers travaux en date démontrent que la spécificité observée de différentes souches virales pour la liaison α-2,3 ou α-2,6 peut en réalité être partiellement due à des effets d’avidité (171,173,176,177). L’avidité peut se traduire par le gain d’affinité obtenu par la multivalence des interactions biologiques analyte-ligand. Ainsi une liaison bivalente peut entrainer une augmentation de l’affinité pouvant aller jusqu’à un KD apparent : 𝐾 , = 𝐾 , (162)1. Le développement et l’utilisation de biocapteurs dédiés à l’analyse des interactions biologiques entre le virus influenza et les glycanes (voir Figure 31) ont permis de démontrer que :
La liaison bidentée qui s’opère entre 2 sites de liaisons d’un trimère de HA et les glycanes à structure poly-branchée présentant des liaisons terminales α-2,6 potentialise l’affinité de la HA pour ces dernières (171) (voir Figure 33).
Les multimères ou « rosettes » de HA du vaccin s’associent à 6-9 résidus de type acide sialique, offrant une constante de dissociation apparente KD,app d’environ 10-9 M (169).
Lors de l’association de particules virales entières à une surface présentant des glycanes multivalents, le virus s’associe par l’interaction multivalente de ~7 trimères de HA (168).
La constante de dissociation apparente évaluée pour les interactions virus influenza-glycanes est alors de l’ordre de 10-9-10-14 M et dépend de la densité surfacique de glycanes (168,172).
La constante apparente du taux d’association ka pour l’association de virus entier à une surface présentant des glycanes multivalents a été évaluée à environ 4.107 M-1.s-1 (et est similaire pour un ligand 3’-SLN et 6’-SLN et indépendante de la densité surfacique de ligand) (172).
1 D’autres critères entrent en jeu lors d’interactions multivalentes et complexifient cette relation (voir (162,169,171) dans le cas du virus influenza).
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L’affinité apparente des antigènes d’influenza varie selon leur valence par effet d’avidité. Les deux degrés de multivalence des interactions entre les particules virales d’influenza et les surfaces fonctionnalisées par des glycanes entrainent une association avec affinité apparente élevée (KD,app
~ 10-14 M).
Figure 33 : Ordres de grandeurs de la constante de dissociation apparente (hormis pour HA-glycane monovalent >
Kd) évaluée pour différentes interactions biologiques HA-ligand ou virus-ligand. Source : (171)
III.4.2. Analyse quantitative de l’hémagglutinine sous forme trimérique