Résultats et conclusions

De la même manière que pour le test SPRi quantitatif précédemment développé, nous avons évalué la biopuce SPRi multiplexée en analysant des échantillons de vaccin commercial purifié et de concentration en µg HA.mL^-1 connue. La Figure 69 détaille les résultats obtenus lors de l’analyse de vaccin trivalent par la biopuce SPRi multiplexée. L’impact de la densité surfacique de ligand sur la réponse SPRi a été évalué par immobilisation de solutions de Fétuine/BSA à différents ratios (v/v). Le Tableau 30 détaille les paramètres cinétiques évalués pour les analyses détaillées dans la Figure 69. On observe un décalage des courbes concentration-réponse lorsque le ratio Fétuine/BSA diminue. Il est possible d’évaluer la réponse selon un modèle logistique (ou équation de Hill) : 𝑅 [%𝑅] = 𝑜𝑢 𝜃 = = (équation 8.1) dont les paramètres évalués sont décrits dans le Tableau 30.

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Avec Rmax la réponse maximum (plateau), A0 la concentration d’analyte, CE50 la concentration efficace pour atteindre 50% de Rmax et nHill le coefficient de Hill qui permet en théorie d’évaluer la coopérativité de l’interaction ⁶.

Figure 69 : Evaluation des paramètres analytiques de la réponse SPRi sur biopuce à glycanes multiplexée lors de l’analyse de vaccin trivalent (Vaxigrip 2017-2018). A/Impact de la densité surfacique de fétuine sur la réponse évaluée à l’équilibre B/Courbes concentration-réponse évaluées pour différents ligands : fétuine et glycanes multivalents C/

Evaluation de la relation entre la densité surfacique relative de fétuine et la fraction saturante f (n=2) D/ Impact de la densité surfacique de fétuine sur la réponse suivant le taux d’association initiale.

Lors de l’interprétation des données pour différentes densités surfaciques de fétuine suivant le modèle logistique, la concentration des lots de vaccins évalués (90 µg HA.mL^-1) ne nous a pas permis d’atteindre la saturation de la surface qui se traduit par l’obtention d’un plateau pour

6 Dans le cas d’une interaction suivant un modèle 1 : 1, nHill = 1 et on obtient CE50=Kd.

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les courbes concentration-réponse (Figure 69A). Cependant, cette concentration était suffisante pour obtenir des coefficients de régression R² ≥ 0,99 pour l’ensemble des analyses.

Les courbes concentration-réponse réalisées nous permettent de valider que la densité surfacique de ligand impacte la réponse SPRi évaluée à l’équilibre (Req) pour les interactions glycanes-HA (voir Figure 69A et C). En effet, d’après les paramètres évalués (Tableau 30), on observe une diminution de Rmax et une augmentation de la valeur de CE50 évaluée lorsque la densité surfacique de ligand diminue (voir Annexe I). A l’inverse, le coefficient de transfert de masse kt (évalué sur la base du taux d’association initiale dR/dt) ne diffère pas statistiquement pour les 3 densités surfaciques de fétuine les plus élevées (kt = 2,74 ± 0,04.10^-2 [%R.min^-1.µg HA^-1.mL], écart-type relatif = 0,7%). Pour le plot FET:BSA 1:9, le dR/dt évalué pour une concentration de 20 µg HA.mL^-1 apparait relativement bas et impacte le kt évalué. Il apparait pertinent de reproduire ces analyses afin d’évaluer plus précisément les kt pour différentes densités surfaciques de ligand.

À partir des données du Tableau 30, il est possible d’évaluer la relation entre la densité surfacique relative de fétuine et la fraction saturante f = Rmax(FET:BSA)/Rmax(FET). Cette méthodologie a précédemment été exploitée pour évaluer le degré d’avidité relatif de différentes souches virales d’influenza (231). Il apparait que f n’est pas linéairement proportionnelle à la densité surfacique de fétuine immobilisée. En effet, la Figure 69C indique un effet d’avidité au niveau des interactions biomoléculaires réalisées entre les multimères de HA et les glycanes présents en surface de la fétuine (effet illustré par la flèche rouge).

Concernant l’évaluation de différents glycanes mono- et multivalents, seul les glycanes multivalents ont permis d’obtenir une réponse SPRi quantifiable (et similaire aux deux densités surfaciques de ligand multivalent évaluées). Par rapport aux constantes d’affinité précédemment évaluées (en unité [M]) pour l’interaction entre la fétuine et les multimères de HA contenus dans le vaccin commercial (voir Tableau 28), on observe que les Kd apparents évalués sur les deux plateformes SPRi sont du même ordre de grandeur (Kd ~ 10^-7 M). Par ailleurs, les courbes concentration-réponse obtenues lors de l’utilisation de glycanes multivalents indiquent un Kd

apparent du même ordre de grandeur que pour la fétuine. Les kt évalués pour ces ligands sont supérieurs, ce qui indique qu’ils pourraient offrir une sensibilité supérieure pour un test SPRi

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quantitatif. Ces résultats restent à confirmer sur une plateforme SPRi plus résolutive dans des conditions de limitation par le transfert de masse (MTL) validées.

Dans l’ensemble, les résultats obtenus sont cohérents avec les performances analytiques du même ordre de grandeur (sensibilité, gamme de travail) évaluées entre les dosages d’activité SPR/ELISA basés sur l’utilisation de glycanes (voir Chapitre II) et le test analytique SPRi précédemment développé (voir Chapitre VII).

Tableau 30 : Paramètres cinétiques évalués à partir des courbes concentration-réponse issues de l’analyse d’échantillons de vaccin commercial (Vaxigrip 2016-2017) pour différents ligands et/ou différentes densités surfaciques de ligand sur la base d’un modèle logistique. Le CE50 est identique au KD dans le cas d’un modèle d’interaction 1 : 1.

Ligand l’équilibre, rejoignant des observations précédentes (231,232). Il est donc important d’obtenir une densité surfacique de ligand constante lors de la réalisation de dosages d’activité/de stabilité selon cette méthodologie. Par exemple, dans le cas du couple ligand-analyte HA-glycane, il est important d’inhiber la lyse des acides sialiques par la NA virale si une régénération du capteur est réalisée. Nous avons également validé que l’utilisation de fétuine ou de glycanes synthétiques multivalents offraient des performances analytiques similaires. Par ailleurs, la puce SPRi multiplexe réalisée constitue un modèle permettant une évaluation de l’avidité relative qui pourrait être utilisée afin de comparer l’avidité relative de différentes souches virales ou formulations vaccinales (par exemple : des formulations de HA multimériques à différents degrés