Le dosage d’activité par SRID : principe et limitations

Le dosage par immunodiffusion radiale (ou Single Radial Immunodiffusion : SRID) est encore à l’heure actuelle l’unique dosage de référence validé par les instances réglementaires pour la quantification des lots de vaccins influenza (51). Il est basé sur l’immunoprécipitation des antigènes de HA lors de leur diffusion dans un gel d’agarose en présence d’un sérum préalablement incorporé (59). L’utilisation d’un sérum permet de cibler différents épitopes de la HA, ce qui permet la formation de complexes HA-anticorps polyclonaux et entraine une immunoprécipitation (60). La variable mesurée est le diamètre du disque d’immunoprécipitation obtenu après diffusion des trimères de HA dans le gel et formation des complexes HA-anticorps

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(34). Le gel est par la suite coloré par du bleu de Coomassie pour révéler les disques d’immunoprécipitation. Ce test a été optimisé de manière à obtenir des résultats fiables lors de la caractérisation des différents types de préparations vaccinales disponibles sur le marché lors de son développement en 1977, à savoir les vaccins inactivés et les vaccins trivalents atténués produits par ovoculture (51). Du fait du pré-traitement de l’échantillon par du détergent zwitterionique, le dosage SRID mesure principalement la HA sous sa forme trimérique (61) (voir Figure 12). Une courbe de calibration intra-analyse est réalisée à partir de réactifs de références de concentration en HA connues et spécifiques à chaque souche vaccinale. Ceci permet d’obtenir une activité relative des lots testés en évaluant le ratio des courbes dose-réponse.

Figure 12 : Principe du dosage des antigènes d’hémagglutinine par la technique d’immunodiffusion radiale

Ainsi, cette méthode nécessite la production de deux réactifs de référence : des sérums et des antigènes. Ces réactifs sont produits par les laboratoires de référence affiliés à l’OMS après la sélection annuelle des souches de références. La production et l’évaluation de ces réactifs est limitante pour la production des lots de vaccin (voir Figure 13). La production des sérums de référence nécessite la génération de HA clivée par la bromélaïne afin d’obtenir des préparations contenant exclusivement le domaine extracellulaire de la HA. Ces dernières sont ensuite injectées chez l’animal. Certaines mutations du site de clivage ont pu bloquer la production de ces antisérums, comme ce fut le cas pour la souche pandémique H1N1 de 2009 (62). On peut aussi observer une variabilité dans les titres obtenus, au niveau de la réactivité croisée ou de la qualité des disques d’immunoprécipitation formés selon les sérums utilisés (51). Il n’est pas nécessaire

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d’utiliser des antigènes issus d’une souche identique à celle contenue dans le vaccin pour la génération de ces sérums, tant que la sensibilité est suffisamment élevée pour permettre une lecture des tests. Cela permet de palier au risque de blocage du procédé dans le cas où la génération annuelle des sérums de référence serait difficile (63).

Figure 13 : Etapes principales du processus de standardisation des lots de vaccins monovalents

Le deuxième réactif utilisé est constitué des antigènes de référence, issus de virus partiellement purifiés, inactivés et lyophilisés (Working Reference Standard dans la Figure 13).

Contrairement aux sérums, ce dernier doit être préparé à partir de la souche de travail testée.

Ceci peut introduire un délai dans le procédé de production. Le laboratoire de référence produit un premier lot (Primary Liquid standard ou PLS) évalué à l’aide d’un dosage des protéines totales et d’une analyse de la quantité relative en HA par densitométrie SDS-PAGE. Ce lot PLS pourra par la suite être utilisé pour calibrer les réactifs de référence, produits et envoyés par un producteur. Ainsi, le lot de PLS et le réactif de travail candidat sont envoyés à au moins 3 laboratoires de référence afin d’être calibrés, de déterminer la qualité des zones d’immunoprécipitation et la gamme de travail analytique (51).

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Les avantages et limitations de la SRID sont détaillées dans le Tableau 4.

Tableau 4 : Avantages et limitations du dosage d’activité par SRID. A partir de (61) et (51)

Avantages Limitations

Simplicité Robustesse Reproductibilité

 Coefficient de variation géométrique inter-laboratoire < 10%

 Ecart-type relatif : 5-20% (64,65) Mesure de la HA active (61,66) :

 Pertinence de la mesure biologique

 Corrélation avec l’immunogénicité

 Permet une évaluation de stabilité

 Production de réactifs de référence souches-spécifiques :

o Sérums (production ~4 mois) o Antigènes de référence

 Reformulation annuelle des réactifs de référence

 Peu adapté à des préparations vaccinales non issues de production par ovoculture

 Sensibilité limitée (LOQ ~ 5 µg HA/mL)

 Applicable uniquement en fin de procédé avant la formulation

 Durée : 1-2 jours Biais de standardisation des réactifs de

référence → Solutions proposées

 Co-migration de protéines autres que HA (jusqu’à 25%) (67)

 Influence de la plateforme d’expression cellulaire des réactifs de référence

 Influence de la méthode d’inactivation

 Digestion des protéines avant migration (68,69)

 Réalisation de réactifs de références spécifiques à chaque plateforme (70)

Les travaux qui ont entrainé en 1977 l’adoption de la SRID en défaveur de l’hémagglutination montrent une corrélation relativement médiocre entre les titres SRID et l’immunogénicité vaccinale jugée par le degré de séroconversion (19,33) (voir Figure 14). Comme le souligne l’EMA : à l’heure actuelle, il « n’existe pas de corrélat exact entre l’activité vaccinale et le résultat clinique (efficacité), puisque ce dernier dépend de la nature du vaccin (ex : entier, sous-unitaire, recombinant), de sa formulation (ajout d’adjuvant), du procédé de production, de la voie d’administration ou de la correspondance entre la souche vaccinale et circulante. Il y a une absence de réelles études concentration-réponse, une variabilité des dosages sérologiques et un manque de connaissances pour l’établissement de corrélats de protection plus significatifs » (lignes directrices de l’Agence Européenne des Médicaments – Module Qualité vaccin influenza – § 4.1.1.1.8 Vaccine standardisation (71)).

La SRID étant la technique de référence actuelle, il est communément admis que les alternatives doivent être évaluées en comparaison de cette dernière (33,51,70). Cependant, du fait du faible

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degré de corrélation entre les titres SRID et l’immunogénicité vaccinale, K. Rowlen a proposé d’évaluer les techniques alternatives, non en les comparants à la SRID, mais directement en dressant des corrélations avec l’efficacité clinique (33). Face à l’émergence de stratégies vaccinales alternatives à l’ovoculture, les réponses envisageables sont : a) évaluer/adapter la technique SRID et les réactifs de référence à chaque nouvelle préparation vaccinale, b) développer des techniques alternatives et/ou orthogonales à cette dernière (41).

Figure 14 : Corrélations obtenues par Ennis et al. (1977) entre le degré de séroconversion et l’activité vaccinale mesurée par SRID ou hémagglutination (CCA = Chicken Cell agglutination). Tiré de (33) d’après (66).