Autres méthodes analytiques

V.7.1. Quantification des protéines totales

Deux méthodes de dosage colorimétriques ont été utilisées pour la quantification des protéines totales des échantillons : le test de Bradford (208) et le test utilisant l'acide bicinchonique (ou BCA pour BiCinchoninic acid Assay) (209).

 Le réactif de Bradford contient du bleu de Coomassie. Ce composé a la capacité de se lier aux résidus basiques et hydrophobes des protéines en milieu acide. Cette interaction aboutit à un déplacement du maximum d’absorption de 465 nm à 595 nm.

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 Le sel de sodium d’acide bicinchonique est un composé stable et hydrosoluble capable de former un complexe violet intense avec un ion Cu¹⁺. Ces ions sont issus de la réduction des ions Cu²⁺ par les protéines dans un environnement alcalin (réaction de Biuret).

Une gamme étalon a été réalisée avec des solutions de BSA à des concentrations situées entre 0 et 250 μg.mL^-1. Un volume donné (20-50 μL) d’échantillon est incubé avec 1 ml du réactif de Bradford ou de réactif BCA (Bradford : 10 min - 25°C ; BCA : 30 min – 50°C). L’absorbance des solutions est ensuite mesurée (Bradford : λ = 595 nm ; BCA : λ = 562 nm). La concentration en protéines dans les échantillons est exprimée en µg.mL^-1.

V.7.2. Titrages infectieux

Deux méthodes de titrage infectieux des échantillons de virus Influenza ont été utilisées : la méthode des plages de lyses et la méthode de la Dose Infectante en Culture Tissulaire 50% (ou DICT50). La méthode des plages de lyse évalue directement le nombre de particules virales infectieuses. La méthode DICT50 évalue elle le pouvoir cytopathogène d’un inoculum de particules virales.

Figure 53 : Effet cytopathique du virus influenza sur cellules adhérentes MDCK. A/Monocouche ou tapis de cellules MDCK saines à confluence ; B/ Observation d’un effet cytopathique (ECP) C/ Destruction du tapis cellulaire

V.7.2.1. Méthode des plages de lyse

Le dosages d’infectivité basé sur la méthode des plages de lyse (ou PFU - Plaque Forming Unit) est une mesure du nombre de particules virales capables de former des plages de lyse (ou

« plaques ») par unité de volume. L’inoculum viral est dilué en série au 1/10° dans le milieu d’infection (voir Tableau 15). Les dosages sont réalisés en plaque de culture cellulaire 6 puits.

Après élimination du milieu de culture MDCK (voir Tableau 15), 800 µL de chaque dilution de virus sont déposés sur une culture de cellules MDCK confluentes puis incubés 1h sous

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agitation constante (Agitateur à balancelle - 30 rpm). Le milieu d’infection est éliminé et les cellules recouvertes d’un milieu semi-solide (mélange 1:1 de milieu MEM et d’une solution d’Agar noble à la concentration de 1,1%). Ce milieu semi-solide a pour objectif de limiter la diffusion des particules virales néoformées. Les boites de culture sont mises à incuber 3 à 4 jours (37°C, 5% CO2) avant dénombrement visuel des plages de lyses induites par effet cytopathique (ECP).

Le titre est évalué selon la formule suivante, en faisant une moyenne sur les puits présentant des plages de lyse visibles et comptabilisables :

𝑷𝑭𝑼. 𝒎𝑳 ^𝟏= 𝑵𝒐𝒎𝒃𝒓𝒆 𝒅𝒆 𝒑𝒍𝒂𝒈𝒆𝒔 𝒅𝒆 𝒍𝒚𝒔𝒆 𝑭_{𝒅𝒊𝒍𝒖𝒕𝒊𝒐𝒏} × 𝒗𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆 𝒅é𝒑𝒐𝒔é [𝒎𝑳]

V.7.2.2. Méthode de la Dose Infectante en Culture Tissulaire 50%

(DICT50)

Le titre DICT50 mesure l’infectivité d’un inoculum de particules virale. L’inoculum viral est dilué en série au 1/10° (50 µL) dans 450 µL de milieu d’infection (voir Tableau 15) avant d’être déposé en quadruplicat (50µL) dans les puits d’une plaque de culture 96 puits de cellules MDCK (à confluence) contenant par ailleurs 150 µL de milieu d’infection. La lecture des titres est réalisée à 96 h post infection par comptage visuel du nombre de puits pour lesquels le tapis cellulaire est sain ou détruit (voir Figure 53). Le calcul de la DICT50 s’effectue selon la méthode statistique de Reed et Muench (115).

V.7.3. Dosages d’activité

V.7.3.1. Immunodiffusion radiale

L’activité des lots de virus inactivés par fragmentation par le TRITON X-100 a été évaluée par immunodiffusion radiale (SRID) selon le protocole standard établi par Wood et al. (59). Les réactifs de référence utilisés pour la calibration ont été fournis par le National Institute for Biological Standards and Control (antigène NIBSC 09/196 et sérum polyclonal NIBSC 14/134 pour le dosage de lot de virus H1N1 A/California/07/2009 fragmenté).

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Figure 54 : A/ Automate de lecture (Protocol 3, Symbiosis) B/ Gel de SRID

Un gel d’indubiose A37 (1%, PALL) contenant le sérum polyclonal de référence (15 µL pour 1 mL) a été formé par dépot sur une plaque de verre avant d’y percer des puits de diamètre ~4 mm. Les antigènes de référence et échantillons ont été incubés 30 min à température ambiante après ajout de Zwittergent 3–14 (1% final). Ces derniers ont été dilués au 1:1; 3:4; 1:2; 1:4 et déposés en triplicata dans les puits du gel. Le gel a été mis à incuber 20 h à 22 °C à l’étuve afin de permettre la migration des antigènes, puis lavé en tampon PBS. Le gel a ensuite été séché à l’aide de papier absorbant (30 min) puis à l’étuve (60°C – 20 min). Le gel a ensuite été teint afin de révéler les complexes d’immunoprécipitation (bleu de Coomassie 0,25%, méthanol 50%, acide acétique 10% v/v, 20 min). Le gel a ensuite été rincé et incubé dans une solution de lavage (méthanol 50%, acide acétique 10%). Les cercles d’immunoprécipitation ont été mesurés à l’aide d’un automate de lecture (Protocol 3, Symbiosis, voir Figure 54). L’activité HA a été évaluée en µg HA.mL^-1 par la méthode de l’analyse des lignes parallèles par comparaison des courbes effet-dose des échantillons et du réactif de référence.

V.7.3.2. Dosage d’activité hémagglutinante

Un dosage de l’activité hémagglutinante a été réalisé afin d’évaluer la perte d’activité des virus dans les surnageants de culture après incubation à 56°C. Le matériel utilisé est détaillé dans le Tableau 16. L’échantillon à doser (50 µL) est dilué en série au 1:2 dans du tampon Salk et incubé avec 50 µL de globules rouges de poule (préparés à 0,5% v/v dans du tampon Salk) une heure à température ambiante. Le titre HA évalué correspond à l’inverse de la dernière dilution pour laquelle une hémagglutination totale ou partielle est observée (équivalent à une absence de précipitation des globules rouges en fond de puit) et est exprimé en unités HA/50 µL. La Figure 55 détaille comment est réalisée la lecture de titre sur plaque 96 puits.

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Figure 55 : Lecture du titre en activité hémagglutinante.

V.7.3.3. Dosage d’activité neuraminidase

Des dosages d’activité neuraminidase d’échantillons de virus influenza et de vaccin ont été réalisés avec un lecteur de fluorescence FLUOstar OPTIMA (BMG LABTECH). L’activité totale NA a été évaluée comme la quantité d’acide 2′ -(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acétylneuraminique (MUNANA, Sigma) dégradée en 4-methylumbelliferone (4-Mu) en 1 h pour un mL de suspension virale (nmol 4-Mu/h/mL).

V.7.4. Densitométrie

La quantité totale de HA présente dans les surnageants de culture a été évaluée par densitométrie après électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) et immunomarquage. Les échantillons ont été traités par ajout de tampon de lyse (tampon commercial : NuPAGE™ LDS 4X, à base de lithium dodecyl sulfate à pH = 8,5), puis ajout de dithiothréitol (DTT, 1% v /v final). Les échantillons ont ensuite été chauffés à 95°C pendant 5 min. Un volume défini (35 µL) d’échantillon a ensuite été déposé dans les puits d’un gel SDS-PAGE 10% avant migration (Tampon Tris-HCl pH=8,5, 110V, 1h30) et transfert sur membrane de nitrocellulose. Un cocktail d’anticorps monoclonaux anti-HA (F211-10A9 et F211-11H12) développés par Manceur et al. a été utilisé comme anticorps primaires (96) dans les conditions indiquées dans le Tableau 24.

L’analyse par densitométrie a été réalisée à partir des films scannés sur le logiciel Image Studio (LICOR Biosciences, Lincoln, NE). Afin de procéder à une analyse quantitative, une gamme de calibration a été réalisée à partir de deux échantillons de référence en parallèle des échantillons de surnageant issus des productions virales : HA recombinante purifiée, exprimée en système HEK293 (H1N1 A/California/2009/07, voir

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Tableau 20) et vaccin tétravalent commercial (Vaxigrip® Tetra 2018-2019, Sanofi Pasteur).

Tableau 24 : Détails des étapes de l’immunomarquage d’hémagglutinine de virus Influenza

Etape Tampons/réactifs Spécifications

Incubation : 4°C sur la nuit Lavage : 3 x PBS-TWEEN 0,1%

Incubation : 1h – agitation – T° ambiante

Lavage : 2 x PBS-TWEEN 0,1%, 1X PBS Révélation Membrane : Hamersham Hyperfilm

Réactif : Pierce® ECL 20-30 min

V.7.5. Analyse des particules totales

Différentes techniques analytiques ont été utilisées pour la caractérisation et la quantification des échantillons de particules virales. De même que pour les dosages d’activité, les titres obtenus ont permis d’établir des corrélations avec les titres obtenus par SPRi.

 Analyses TRPS

Des analyses TRPS ont été réalisées via une prestation à l’aide de l’appareil qNano Gold (IZON Science, Lyon, France). Les échantillons ont été dilués au 1/5 dans du tampon PBS avant analyse en duplicat. Des membranes en polyuréthane possédant des pores de taille ajustable d’un diamètre basal de 150 nm (NP150, IZON) ont été utilisées. Avant analyse des échantillons, des calibrations ont été réalisées par passage de suspensions standards constituées de nanosphères de polystyrène de 150 nm de diamètre modal (CPC150, IZON).