Traitement du fond de fluorescence

2.5.2.1 Nature et composantes du fond de fluorescence

Le fond de fluorescence parasite sur une image peut-être divisé en 2 composantes : 1) une composante lentement variable spatialement qui correspond à la moyenne du fond en chaque

point. 2) Une composante qui varie rapidement selon la position spatiale. Cette composante appelée bruit correspond à l’écart-type du fond.

F ond =< F ond > +σB

σB ne correspond pas seulement au bruit de fluorescence parasite. Il existe d’autres sources

de bruit comme le bruit d’amplification et le bruit de lecture propre à la caméra CCD. Mais on considère dans notre cas que ces autres sources de bruit sont négligeables devant le bruit de fluorescence parasite : σB ∼ σBf . Le bruit de fluorescence est proportionnel à la racine-carrée du flux local d’excitation (σBf ∝

√

N). Donc si l’on est dans une zone où le signal de fluorescence est plus élevé, le bruit de fluorescence le sera aussi.

Figure 2.18 – Profil spatial du flux local des pixels issus d’une section horizontale sélectionnée au centre de l’image 2.17a

La figure 2.18 permet d’identifier facilement la composante lentement variable du fond (l’en- veloppe du profil spatial). Il est en revanche plus difficile de visualiser les variations rapides qui participent aussi des pics de signal.

A ce fond de fluorescence présent sur toutes les images s’ajoute pour nombre d’entre elles le fond de fluorescence propre au RRL visible sur la figure 2.17d.

2.5.2.2 Soustraction du fond par Rolling Ball

Pour soustraire à nos images la partie lentement variable du fond de fluorescence on utilise une technique de traitement d’image appelée Rolling Ball.

Mais avant tout traitement, il nous faut réaliser des opérations préliminaires sur le logiciel Fiji. On sépare dans un premier temps les images acquises dans le rouge de celles acquises dans le vert. A partir du film initial, on récupère deux films, un pour chaque couleur.

On effectue ensuite une soustraction du fond par Rolling Ball. Le Rolling Ball est une opé- ration mathématique sur une image, utilisée pour soustraire le fond de l’image sans dégrader le

signal d’intérêt. Le principe est de considérer l’image comme une surface sous laquelle on fait parcourir une sphère de rayon donné. Cette sphère est choisie pour être suffisamment large pour couvrir, lors de son déplacement, la forme générale de la surface dont les variations spatiales sont lentes sans pouvoir entrer dans les pics du signal. La surface couverte par la sphère est alors considérée comme le fond de fluorescence et sera soustraite à l’image.

Figure 2.19 – Schéma explicatif de la méthode du Rolling Ball en 1D

L’avantage de cette méthode est d’être utilisable même si l’on ne connait pas a priori la forme du fond de fluorescence. Nous utilisons après différents tests une sphère d’un rayon de 20 pixels. En effet, les pics de signal correspondant à nos molécules uniques ne font pas plus de quelques pixels2_{. Choisir une sphère avec un diamètre de 20 pixels nous assure de ne pas dégrader le signal}

de nos molécules.

(a) (b)

Figure 2.20 – Effet dde l’opération de Rolling Ball sur le profil spatial du fond de fluorescence. (a) Profil spatial de l’intensité sur l’image 2.17a avant Rolling Ball. (b) Profil spatial d’intensité sur l’image 2.17a après Rolling Ball

Le résultat de cette opération est présenté dans la figure 2.20. On constate que le Rolling Ball a bien permis de soustraire la composante lentement variable du fond de fluorescence. Il est en particulier efficace pour minimiser le fond de fluorescence du RRL. En revanche le bruit de

fluorescence (fluctuations du fond) ne peut-être soustrait par cette méthode. Nous résoudrons cette question lors du traitement par le logiciel IGOR Pro présenté plus loin.

Après le traitement par Rolling Ball on termine la prise en charge des films sur Fiji en corrigeant les films d’une translation systématique de 1 pixel observée empiriquement entre les images dans le rouge et les images dans le vert. Cette translation peut-être due à différents biais expérimentaux, optiques ou simplement liés à l’échantillon. Nous n’en cherchons pas la cause car cette dérive étant systématique, elle est aisément corrigible. Les deux films sont prêts à être traités et analysés avec le logiciel IGORPro pour la suite des opérations.

2.5.2.3 Soustraction du bruit de fluorescence des images

Après l’opération de Rolling ball il ne reste que les fluctuations du fond (bruit de fluorescence) et le signal des fluorophores. Sur la figure 2.20b on voit bien que le signal et les fluctuations du fond sont plus basses sur les bords de l’image qu’au centre. Cela est dû au fait que l’excitation n’est pas homogène sur l’ensemble de l’image, elle est plus forte au centre. On doit renormaliser l’image pour corriger cet effet.

Pour ce faire, on calcule la moyenne locale de l’intensité I(x, y) : < I(x, y) >loc (on moyenne

les pixels avec leur voisinage, en considérant un voisinage de 50 pixels). Ce procédé dessine une carte qui rend bien compte de l’intensité d’excitation laser sur l’ensemble de l’image et de ses inhomogénéités. Le bruit de fluorescence étant proportionnel à la racine carrée du flux local d’excitation, on considère que : σBf ∝ p< I(x, y) >loc. Nous pouvons donc déterminer pour

l’ensemble des pixels la valeur des fluctuations du fond résiduel et renormaliser l’image par cette grandeur pour rendre ces fluctuations homogènes spatialement en calculant :

I(x, y) p< I(x, y) >loc

Il est important de noter que par cette opération le signal de fluorescence est lui-même renormalisé. Les pics de signal correspondants aux particules centrales (qui sont plus éclairées que celles en périphérie et donc plus brillantes) sont renormalisés au même titre que le bruit de fluorescence.

Le fond résiduel est très faible et ses fluctuations sont renormalisées sur l’ensemble de l’image. Nous pouvons désormais, par une opération de seuillage, séparer le signal du bruit de fluorescence pour détecter nos fluorophores uniques.