Différentes possibilités pour augmenter le temps de vie de nos

3.2.3.1 Différentes possibilités pour augmenter le temps de vie de nos marqueurs fluorescents

Utilisation d’un système ROXS L’utilisation d’un couple oxydant réducteur (système ap- pelé ROXS pour Reducing and Oxidizing system) couplé à un système enzymatique pour dépléter

le milieu en oxygène a été testé lors des thèses précédentes. La présence d’oxygène dans le mi- lieu est en partie responsable du phénomène de photoblanchiment par la création de radicaux libres. Cependant, l’oxygène diminue aussi la durée de vie de l’état triplet ce qui ramène les fluorophores dans leur état fondamental. Le couple oxydant réducteur vient remplacer l’oxygène dans ce rôle, et combiné au système enzymatique, il permet d’augmenter notablement la durée de vie des fluorophores sans diminuer le taux de fluorescence. Seulement les tests effectués avec ce système, bien que très concluants dans le tampon TRIS (durée de vie augmentée jusqu’à 30 fois sous excitation laser) se sont révélés beaucoup moins concluants dans le RRL, milieu très riche en oxygène (cf. [Fiszman 2013]). Non seulement la durée de vie des ATTO n’a pas été nettement augmentée, mais en plus l’amélioration de la durée de vie nécessite quelques dizaines de minutes pour être effective, ce qui n’est pas négligeable à l’échelle de nos expériences. Il exis- tait donc un risque que la durée de vie des fluorophores varie au cours de l’expérience, ce qui est un problème si l’on souhaite estimer la contribution du photoblanchiment pour pouvoir la soustraire et extraire le seul signal de traduction. Cette méthode d’amélioration de la durée de vie des marqueurs a donc été abandonnée.

Fluorophores chimiquement protégés Il est aussi possible d’agir sur les propriétés pho- tophysiques intrinsèques des marqueurs fluorescents par des procédés chimiques décrits dans la littérature [Altman 2012].

Les auteurs décrivent dans cet article des systèmes inhibiteurs de l’état triplet nommés Tri- plet State Quenchersou TSQ (COT, NBA et Trolox)). Ces molécules vont diminuer la durée de vie de l’état triplet, afin d’augmenter la durée de vie avant photoblanchiment du fluorophore et évitant les réactions de dégradation photo-induites subies par le fluorophore pendant son passage dans l’état triplet. Si ces molécules sont généralement utilisées en solution dans le mi- lieu d’étude à des concentrations mM, les auteurs proposent ici de les greffer directement sur le fluorophore pour le protéger. La sous-figure 3.5.a. présente la structure chimique générale de ces fluorophores modifiés3 _{et les sous-figures b. et c. illustrent des mesures de leurs proprié-}

tés photophysiques. Les auteurs ont vérifié que les caractéristiques spectrales des fluorophores sont inchangées par rapport à celles des cyanines dont ils sont dérivés (spectres d’absorption et d’émission, rendement quantique...). Ce fait étant établi, l’étude peut se concentrer sur le paramètre photophysique le plus significatif : le temps moyen passé dans l’état fluorescent de la molécule τON (s)4. Comparé à l’ajout des molécules TSQ en solution ou à la molécule de

cyanine seule, le temps moyen τON est nettement supérieur pour les fluorophores directement

protégés (cf. figure 3.5, b). Des premiers tests ont été réalisés in-vitro en étudiant des complexes fluorophores-ADN immobilisés en surface et éclairés par un laser à 640nm. Un système éliminant l’oxygène du milieu est utilisé pour limiter le photoblanchiment. Le temps de vie avant photo- blanchiment dans ces conditions est multiplié par plus d’un facteur 10 dans le cas du fluorophore Cy5-Trolox en comparaison avec la cyanine seule. (cf. figure 3.5, c et 3.6, a).

3. La fonction NHS permet une accroche spécifique sur des fonctions amines, typiquement sur les lysines des protéines

4. Pour une molécule qui ne clignote pas, c’est équivalent à la durée de vie avant photoblanchiment, mais lorsqu’on travaille dans des milieux appauvris en oxygène, et avec des inhibiteurs de l’état triplet, on peut avoir des phénomènes de clignotement appuyés, avec des périodes de fluorescence, entrecoupées de périodes plus ou moins longues dans l’état triplet.

Figure 3.5 – Figure adaptée de [Altman 2012]. Propriétés photophysiques in-vitro et dans un milieu déplété en oxygène pour des fluorophores protégés par couplage direct de molécules TSQ. Test des pro- priétés photophysiques des marqueurs protégés comparés au fluorophore seul et à l’ajout des TSQ en solution. a. Structure topologique d’un fluorophore couplé à un TSQ. b. Temps de vie avant photoblan- chiment pour : une cyanine seule, l’ajout de TSQ en solution, le fluorophore protégé avec couplage direct à différents TSQ. c. Evolution de l’intensité de fluorescence au cours du temps pour une cyanine seule et pour une cyanine couplée à un TSQ.

Les auteurs ont également étudié leur système in-vivo dans des cellules d’ovaires de hamster marquées par les différents types de fluorophores. Ici aucun système d’élimination de l’oxygène n’est utilisé. On constate que même dans ces conditions, les performances des fluorophores pro- tégés en terme de photophysique sont très supérieures aux fluorophores non modifiés (cf. figure 3.6). Il est notable que selon les conditions de l’expérience, le fluorophore protégé qui présente les meilleures propriétés photophysiques peut varier. Pour l’étude in-vitro, c’est clairement le dérivé Cy5-Trolox alors que pour l’étude in-vivo Cy5-COT et Cy5-NBA sont plus adaptés.

En nous référant aux résultats de cet article, nous avons souhaité faire appel à cet outil pour améliorer les propriétés photophysiques de nos fluorophores. Nous avons pris contact avec la startup Lumidyne technology qui synthétise des fluorophores protégés et avons commandé des fluorophores adaptés à notre étude. Les résultats des tests effectués avec ces marqueurs protégés dans les conditions de nos expériences sont exposées dans la section qui suit.

Figure 3.6 – Figure adaptée de [Altman 2012]. Propriétés photophysiques des fluorophores protégés in-vivo et sans déplétion en oxygène. a. et b. .Courbes d’évolution de l’intensité de fluorescence au cours du temps pour des cyanines seules et des cyanines couplées à une molécule de TSQ. c., d. et e. images prises en microscopie de fluorescence illustrant le photoblanchiment des fluorophores au cours du temps pour des fluorophores seuls et des fluorophores protégés par ajout d’une molécule de COT (Cy5-COT)

3.2.3.2 Tests avec l’hybridation de marqueurs Lumidine (LD) chimiquement pro-