La préparation de l’échantillon commence la veille de l’expérience par le montage de la cellule microfluidique décrite dans le chapitre 2, section 2.3.1.1. Une fois cette cellule montée à partir de sa partie réutilisable et des lames de verre propres (soumises préalablement 10 min à un plasma d’oxygène. PO2 = 0,6 mbar), on commence le protocole de chimie de surface.
A.2.1 Protocole de chimie de surface
Recette des Tampons TRIS salé (50 mM final en TRIS et 250 mM final en NaCl, pH=7,5) et Borate (100 mM final en acide borique, pH=8,8) Deux tampons sont utilisés dans notre protocole de chimie de surface : le tampon borate et le TRIS HCl. Les recettes de ces tampons sont données ci-dessous :
Préparation du tampon TRIS HCl salé 1x
• On dissout 303 mg de TRIS (trishydroxyméthylaminométhane) en poudre dans 30 ml d’eau ultrapure.
• On ajoute 730 mg de NaCl en poudre pour obtenir une solution de TRIS dite salée. On ajoute de l’eau ultrapure si la dissolution est difficile.
• On mesure le pH (à l’aide d’un pHmètre) et on ajuste ce pH à 7.5 grâce à l’adjonction d’une solution de HCl concentrée à 1 M1. Une fois le bon pH atteint, on complète avec de
l’eau ultrapure jusqu’à atteindre le volume final de 50 ml. Cette solution finale de TRIS HCl salé peut être conservée à température ambiante.
Préparation du tampon borate
• On dissout 310 mg d’acide borique H3BO3 en poudre dans 30 ml d’eau ultrapure. 1. Il faut ajouter généralement plusieurs ml de solution de HCl à 1 M.
• On mesure le pH (à l’aide d’un pHmètre) et on ajuste ce pH à 8.8 grâce à l’adjonction d’une solution de soude NaOH concentrée à 10 M2. Une fois le bon pH atteint, on complète
avec de l’eau ultrapure jusqu’à atteindre le volume final de 50 ml. Cette solution finale de tampon borate peut être conservée à température ambiante.
Etapes de la chimie de surface
1. Pour la première étape de passivation, on dilue 20 mg de PEG-Silane en poudre (aliquoté et conservé à -80˚C) dans 400 µl de tampon borate jusqu’à dissolution totale. Cette solution est ensuite mélangée à 5 µl de solution de biotine-PEG-Silane (dilué à 200 g/l dans du méthanol et conservé à -80˚C sous la forme d’aliquots de 5 µl ). On injecte le mélange dans les canaux des cellules microfluidiques (40 µl par échantillon).
2. Le mélange incube une heure à température ambiante.
3. Après une heure, on rince le canal avec du TRIS HCl. On prépare de suite une solution de BSA (Bovine Serum Albumine). La BSA se présente sous forme de cristaux que l’on dissout dans le TRIS à une concentration de 10 g/l. On prépare environ 1 ml de cette solution que l’on répartit dans l’ensemble des réservoirs. On injecte cette solution. 4. La solution de BSA incube environ 12h00 (toute la nuit) à température ambiante dans
les échantillons
5. Le matin (jour de l’expérience), on rince la solution de BSA avec du TRIS HCl. On prépare alors une solution de neutravidine diluée à 0,1 g/l dans du TRIS HCl, que l’on injecte dans l’ensemble des canaux.
6. La neutravidine doit incuber au minimum 5 min. L’échantillon est alors prêt à recevoir les systèmes biologiques.
A.2.2 Préparation et injection des systèmes biologiques
Protocole de préparation de l’hybridation mère
5 µl d’ARN messager (1 µM)
2 µl oligo-fluorophore rouge (10 µM) 2 µl oligo-fluorophore vert (10 µM) 0,5 µl oligonucléotide biotinylé (10 µM) 0,5 µl tampon T4DNA ligase
10 µl d’hybridation mère (0,5 µM en ARNm ; 0,25 µM en oligo-biotine et 2 µM en oligo- fluorophores rouge et vert)
Cette solution est incubée 5 min à 68˚C, 5 min à 37˚C et enfin 5 min dans la glace à 4˚C.
Série de dilution On n’injecte pas l’hybridation mère telle quelle, on effectue d’abord deux dilutions successives dans un tampon appelé tampon B (recette dans le paragraphe suivant). On réalise systématiquement une première dilution au 1/100e puis une seconde dilution environ au
1/25e, qui peut varier selon les échantillons. La solution diluée est chauffée 10 min à 30˚C avant
d’être injectée dans l’échantillon.
Recette du Tampon B
333 µl de solution d’acétate de sodium (3 M) 1 ml de solution d’acétate de potassium (1 M) 8,421 ml d’eau ultrapure
200 µl de solution d’Hepes (1 M ; pH=7,8) 25 µl de solution d’acétate de magnésium (1 M) 20 µl de solution de DTT (1 M)
1 µl de solution de spermidine (2,5 M)
10 ml de solution finale de Tampon B (20mM Hepes pH = 7,8 ; 250mM acétate de sodium ; 100 mM acétate de potassium ; 2,5 mM acétate de magnésium ; 2 mM DTT et 0,25 mM spermidine)
A.2.3 Préparation et injection du RRL dans l’échantillon
Recette du Lysat de réticulocyte de lapin : RRL 17,5 µl de RRL pur (Promega)
6 µl eau ultrapure 1 µl SuperasIn
0,5 µl acides aminés-Met (Promega)
19 µl de solution de RRL
On injecte cette solution dans l’échantillon installé sur le microscope lorsque l’on veut com- mencer à acquérir la cinétique de traduction.
Protocole de fabrication des ARN
messagers rapporteurs
B.1 Principe du protocole
La fabrication des ARN messagers part de la construction d’un plamide d’ADN jusqu’à la production en quantité de l’ARN messager correspondant. En fait, il existe deux parties à ce protocole de fabrication. La première partie consiste à insérer la séquence d’intérêt (commerciale et vérifiée par séquençage) dans un vecteur appelé pUC19. Les vecteurs plasmidiques sont de petites molécules d’ADN circulaire qui servent de véhicule pour la multiplication et la sélection de l’insert d’intérêt. Les vecteurs sont capables de se répliquer de manière autonome dans une cellule hôte donnée. Ils possèdent également un gène de sélection (gène de résistance à un antibiotique), de façon à ce que seules les cellules hôtes qui expriment le plasmide puissent survivre et proliférer.
Figure B.1 – Plasmide correspondant à la combinaison d’un vecteur ADN plasmidique et de la séquence d’intérêt. En orange l’origine de réplication, en jaune le gène de résistance aux antibiotiques et en bleu la séquence d’intérêt.
On insère la séquence d’intérêt dans le vecteur pUC19 ; l’ensemble forme un plasmide dit recombiné (on parlera de plasmide par la suite). Je ne me suis jamais impliquée moi-même dans la construction du plasmide, réalisée par nos collaborateurs biologistes, je ne la décrirai donc pas en détail.
Une fois le plasmide construit et validé, il nous faut le produire en grande quantité et effectuer les étapes qui permettront de passer d’un ADN à de l’ARNm, forme utile pour nos expériences. Cette seconde partie correspond à un protocole de biologie moléculaire dont la plupart des étapes sont des protocoles classiques. J’ai réalisé moi même à plusieurs reprises les étapes du protocole permettant d’aboutir à des ARN messagers à partir d’une construction donnée. Il y a plusieurs raisons à cet investissement. C’était d’abord un passage nécessaire pour prendre conscience des contraintes associées à cette étape pour nos collègues biologistes. En effet, le protocole décrit ci- dessous se déroule au minimum sur une semaine et bien souvent, du fait d’aléas expérimentaux, sur deux à trois semaines. Prendre conscience de cette limitation est essentiel quand on travaille avec des échantillons biologiques de cette sorte, elle prend par exemple toute son importance quand nous devons considérer la nécessité de produire de nouveaux échantillons. De plus, il n’y avait pas un recouvrement complet entre ma thèse et celle d’Olivier Bugaud, doctorant biologiste sur le projet, il était donc important que j’acquière au maximum une autonomie sur la fabrication de nos échantillons. Je décrirai dans cette annexe l’ensemble du protocole qui permet de passer d’une construction sous la forme d’un ADN plasmidique à nos ARN messagers prêts à être étudiés en molécule unique.