Stabilité des marqueurs à l’issue des améliorations réalisées

L’action sur les différents paramètres thermodynamiques a permis de réduire notablement l’instabilité des sondes fluorescentes. L’étape de pré-chauffage de l’hybridation a contribué à ré- duire les départs spontanés dans le tampon B. L’utilisation d’un tampon de rinçage a contribué à diminuer la déstabilisation des sondes fluorescentes au moment de l’injection du RRL. Mais l’élément qui a apporté le plus grand gain en terme de stabilité est l’utilisation des oligonucléo- tides allongés (15 nucléotides contre 12 auparavant), qui a eu un impact positif important, tant dans le tampon B que dans l’extrait cellulaire RRL.

Figure 3.17 – Courbes de départs cumulés dans le rouge correspondant à l’acquisition d’un film lent (pointillés) ou d’un film rapide (trait plein) dans le tampon B. Ces acquisitions récentes illustrent les performances atteintes en terme de stabilité thermodynamique des sondes fluorescentes.

La figure 3.17 présente des courbes de départs cumulés dans le tampon B acquises récemment et qui illustrent les gains en terme de stabilité obtenus grâce à l’ensemble de nos actions. La courbe en pointillés correspond à l’acquisition d’un film rapide et celle en violet à l’acquisition d’un film lent7_{, les autres conditions expérimentales étant identiques. On constate que la pro-}

portion de départs à un instant t pour le film lent est peu différente de celle pour le film rapide. Le photoblanchiment étant conservé entre ces deux acquisitions, cette faible différence est due à une faible proportion de sondes fluorescentes affectées par l’instabilité thermodynamique.

On peut donc conclure que, dans le tampon B, nous avons grandement réduit cette source de bruit à l’échelle de nos expériences. L’instabilité est plus importante lorsque nos marqueurs sont dans le RRL. Toutefois, nous sommes aussi parvenus à la diminuer grandement dans ce milieu. L’ensemble de ces améliorations a constitué un tournant dans nos expériences, la diminution importante des départs spontanés a permis de sortir de façon évidente le signal de traduction du bruit. Dans ces conditions, l’hybridation est suffisamment stable pour que nous n’ayons plus besoin de recourir à un tampon de rinçage.

7. cf. description des conditions d’acquisition des films rapides et lents dans la sous-section 3.2.3.2 de ce chapitre, page 94.

3.5 Conclusion

Ce chapitre récapitule l’un des deux aspects principaux de mon travail de thèse. Partant d’un dispositif et d’un protocole existant, nous nous sommes appliqués à étudier chaque aspect de l’expérience dans le but de l’optimiser. Nous avons été guidés à chaque pas par ce que l’expérience nous avait permis de définir comme l’expérimentation modèle. Celle-ci est caractérisée par un ensemble de paramètres physico-chimiques et biologiques que nous avons pu identifier et que nous avons essayé d’optimiser un par un avec les moyens d’actions à notre disposition.

En particulier nous sommes parvenus à réduire les deux principales sources de bruit en concurrence avec la traduction : l’instabilité thermodynamique et le photoblanchiment. En ap- portant des améliorations à notre dispositif optique nous sommes parvenus à diminuer gran- dement le photoblanchiment de nos marqueurs tout en améliorant notre rapport signal/bruit. Pour ce qui est des instabilités thermodynamiques, le choix de rallonger les oligonucléotides sur lesquels sont fixés les marqueurs fluorescents a été payant, puisque les départs dus à une insta- bilité sont désormais minoritaires lors d’une acquisition par rapport au photoblanchiment. En réduisant ainsi les sources de bruit de notre mesure, il nous est beaucoup plus facile d’acquérir et d’interpréter un signal puisque l’on est sûr qu’il est biologiquement significatif.

Nous avons au terme de cette démarche atteint des conditions de reproductibilité, de stabilité et de confort expérimental qui nous permettent désormais de nous concentrer sur les probléma- tiques biologiques et leur difficultés inhérentes. C’est ce qui constitue le deuxième aspect de ma thèse : aller au delà d’une preuve de principe en posant de nouvelles questions biologiques à partir de nos acquis. Ce second objectif fera l’objet du chapitre qui suit.

Caractérisation de la traduction

eucaryote initiée par une IRES : mise

en lumière d’une cinétique à deux

temps caractéristiques

Sommaire

4.1 Etude de la cinétique d’initiation et d’élongation . . . 114 4.1.1 Cinétiques de départs cumulés : acquisition et évaluation de la variabilité . 114 4.1.2 Cinétiques de départs : histogramme et départs instantanés . . . 116 4.2 Etude de l’initiation par une IRES CrPV en présence de ribosomes

pré-incubés . . . 119 4.2.1 Système biologique . . . 119 4.2.2 Une dynamique à deux temps : modélisation des courbes cinétiques . . . 119 4.2.3 Interprétation biologique des temps caractéristiques longs et courts . . . 124 4.3 Un second contrôle biologique : expériences avec les ribosomes du RRL 127 4.3.1 Description de l’ARNm . . . 127 4.3.2 Courbes cinétiques avec les ribosomes du RRL . . . 127 4.3.3 Comparaison des cinétiques des ribosomes endogènes et des ribosomes pré-

incubés . . . 129 4.3.4 Efficacité de reconnaissance et de traduction . . . 129 4.4 Bilan : quelles conditions d’études choisir pour la suite du projet ? . . 131 4.5 Conclusion . . . 132

Une fois les expériences réalisées et les données traitées, on a alors en notre possession une information cinétique à l’état brut qui doit être analysée et ajustée avec un modèle adéquat pour permettre une interprétation biologique. Nous exposerons dans ce chapitre un modèle permettant de décrire nos cinétiques de traduction et comment ce modèle aboutit à une conclusion biologique concrète sur l’interaction entre le ribosome et l’IRES CrPV utilisée pour initier la traduction.

Nous comparerons ensuite le comportement de deux types de ribosomes. Nos expériences sont initialement réalisées en pré-incubant des ribosomes purifiés à partir du RRL sur nos ARNm. Or l’extrait cellulaire RRL contient lui-même des ribosomes. Aussi, deux types de ribosomes sont en concurrence dans le milieu d’étude quand on réalise nos acquisitions, et ces deux populations sont indissociables au vu de nos cinétiques. Pour évaluer l’impact de la présence de ces ribosomes endogènes sur la cinétique, nous présenterons les résultats d’expériences où nous ne pré-attachons

pas de ribosomes sur l’ARNm. On observe alors exclusivement la cinétique des ribosomes du RRL.

4.1 Etude de la cinétique d’initiation et d’élongation

4.1.1 Cinétiques de départs cumulés : acquisition et évaluation de la varia-