III.1.3.Critères d’exclusion
IV. ISOLEMENT ET CARACTERISATION DES CELLULES DE L’USC
IV.1.2. Les tests fonctionnels
Plusieurs méthodes sont disponibles pour évaluer les propriétés fonctionnelles des CSH CD34+ isolées de l’UCB. On distingue les tests in vitro et les tests in vivo.
IV.1.2.1. In vitro
Le test des progéniteurs clonogéniques (CFU-GEMM)
L’essai de progéniteurs clonogéniques myéloïdes est le test standard in vitro permettant de déterminer le potentiel de différenciation des cellules CD34+, puisqu’il permet la culture des progéniteurs myéloïdes, granulocytaires, érythrocytaires et mégacaryocytaires [202].
Selon le type de cellules présentes dans les colonies, on distingue des progéniteurs granuleux et/ ou macrophagiques ( colony-Forming unit
granulocyte ou CFU-G, Forming unit macrophage ou CFU-M,
colony-Forming unit granulocyte-macrophage ou CFUGM) , des progéniteurs
érythroïdes ( burst-Forming unit erythrocyte ou BFU-E et colony-forming unit
erythrocyte ou CFU-E) , des progéniteurs mégacaryocytaires (CFU-Meg ou
CFU-MK) et des progéniteurs exprimant plusieurs potentialités ( colony-Forming unit granulocyte erythrocyte macrophage megakaryocyte ou CFU-GEMM ou CFU-Mix ) [141].
Les études comparant les propriétés clonogéniques des CSH de l’USC à ceux de MO et du SP adulte, rapportent que les CFU de l’USC forment des colonies plus grosses et présentent une plus grande capacité proliférative [142], [143] .
Ultérieurement, il a été démontré, par plusieurs auteurs, que ces cellules différaient de celles de la moelle en terme de taille des colonies [144], de survie en culture à long terme [145]et en terme d'expansion in vitro [146]
.
Long Term culture-initiating cell (LTC-IC)
On retrouve les CSH dans le sang du cordon sous deux formes : la première dite CSH à long terme (LT) ou long term hematopoeitic stem cells (LT-HSCs) qui gardent leur potentiel d’autorenouvellement approximativement pendant 6 mois, la deuxième dite CSH à court terme ou small term hematopoeitic stem cells (ST-HSCs) caractérisées par une capacité d’auto-renouvellement qui ne dépasse pas quelques semaines.
Les LT-HSC peuvent s'auto-renouveler et donner naissance aux ST-HSCS, qui sont également multipotentes, mais démontrent une activité d'autorenouvellement plus limitée. Les ST-HSC se différencient en progéniteurs multipotents (MPP), difficiles à distinguer des ST-HSC.
Le LTC-IC est un système de culture in vitro qui identifie et énumère les précurseurs hématopoïétiques sur la base de leur capacité à produire une descendance myéloïde identifiant ainsi les LT-HFCs des ST-HFCs.
La culture se fait sur un tapis de cellules stromales de la MO, sans addition de cytokines exogènes, à 37°C et 5% CO2, afin de reproduire les conditions où se déroule l’hématopoïèse in vivo chez l’Homme.
La lecture du résultat est réalisée après 5 à 10 semaines de culture en comptant le nombre de puits qui contiennent une colonie. La fréquence de puits positifs est proportionnelle au nombre CSH primitives présentes dans l’USC [164]. De nombreuses études ont confirmé que les CSH de l’USC possèdent une
plus grande proportion de progéniteurs immatures par rapport à la MO et au SP adulte [147] [148].
IV.1.2.2. In vivo
Il s’agit de l’étude de la capacité des CSH à reconstituer toutes les lignées hématopoïétiques in vivo [148]. Ces tests utilisent le plus souvent des modèles animaux pour estimer directement ou indirectement la capacité de repeuplement à long terme de ces cellules en cas de transplantation humaine. Le modèle murin NOD-SCID est le plus souvent utilisé .Il s’agit d’un modèle de souris immunodéficientes portant la mutation SCID sur un fond génétique NOD Non Obese Diabetic permettant de diminuer, l’activité des cellules NK Natural Killer et des cellules présentatrices [149].
Les CSH de l’USC administrées par voie intraveineuse, colonisent la MO murine et rétablissent les lignées hématopoïétiques humaines [150] . Le nombre de CSH du sang de cordon humain, capables de reconstituer la MO des souris est de 1x106 cellules nucléés contre 3 à 6 x 106 cellules nucléés de MO adulte [151].
IV.1.3.Amplification
Différents essais cliniques montrent la possibilité d’accélérer la reconstitution hématopoïétique post-greffe si les cellules greffées sont
amplifiées ex vivo de façon appropriée. Une des premières études visant à tester l’expansion des CSH en culture a
utilisé une approche qui consistait à greffer à des patients une USC séparée en deux fractions; une fraction non manipulée et une fraction expansionnée, afin d’éviter d’utiliser deux unités de sang de cordon [152].
La partie non manipulée du sang de cordon était donc infusée aux patients, et l’autre fraction mise en culture pendant 10 jours avec un cocktail de cytokines comprenant du stem cell factor (SCF), granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) et de la thrombopoiétine (TPO). Cette fraction était par la suite infusée aux patients.
Bien que la culture des cellules avec les cytokines ait permis des expansions de 56 fois des cellules mononuclées et de 4 fois des cellules CD34+, aucune amélioration dans le délai avant la prise de greffe n’a pu être observée chez les patients recevant des cellules cultivées de cette façon.
Toutefois, cette étude a démontré que la greffe de cellules cultivées in vitro était sécuritaire, encourageant ainsi plusieurs autres équipes de recherche à
poursuivre sur la voie de l’expansion des CSH. Cependant il existe un grand nombre d’études destinées à mettre au point
tous les ingrédients de la culture nécessaires pour une amplification optimale [153].
Ces études portent sur : les milieux de culture [154],[155], les cytokines (combinaison, concentrations) [156] [157], l’effet de la présence d’une couche de cellules stromales [158],et le type de culture (les simples cultures liquides statiques ou avec différents « bioréacteurs)[159] [160] .
En effet les cultures dans un milieu sans sérum HP-01, SCF, FLT3 L, et TPO, GSCF, permettent une expansion des progéniteurs et des cellules CD34+ d’un facteur supérieur à 100 sans altérer leur capacité de greffe sur des souris immuno-déficientes[110][152].
La difficulté de cette approche vient du fait que les mécanismes entourant la capacité d’auto-renouvellement des CSH ne sont pas encore bien compris.
de progéniteurs hématopoïétiques, mais poussent les CSH vers la différenciation, affectant la capacité de reconstitution à long terme des cellules.
Le manque de succès de cette approche a mené la communauté scientifique à chercher d’autres façons de procéder à l’expansion des CSH en culture, notamment en travaillant sur des voies de signalisations moléculaires, et en utilisant des facteurs de transcription ou encore des composés chimiques à la pace de cytokines ( voir METHODES D’OPTIMISATION DES GREFFES DE CSH DE SANG DE CORDON OMBILICAL) .