III.1.3.Critères d’exclusion
IV. ISOLEMENT ET CARACTERISATION DES CELLULES DE L’USC
IV.1.1. Isolement et caractérisation
Masquées au milieu de populations hétérogènes, les CSH sont difficilement accessibles, puisqu’elles sont ne sont pas identifiables morphologiquement. Cependant de nouvelles techniques développées permettent de reconnaitre les CSH . Les CSH font parties de la population de cellules mononuclées (CMN) contenues dans le sang de cordon [127].
Une méthode largement utilisée pour l’isolement initial des CMN est basée sur la séparation des cellules par centrifugation en gradient de densité dans un milieu Ficoll (figure19). En effet le sang collecté est dilué à un demi avec une solution stérile à base de tampon de phosphate salin PBS. Ensuite deux volumes de sang dilué sont déposés délicatement à la surface d’un volume de milieu de séparation contenu dans un tube Falcon de 50 ml. Après centrifugation , les globules rouges sont agglutinés par le Ficoll (polysaccharide hydrophile de haut poids moléculaire) [128], et sédimentent au fond du tube, tandis que les CMN se retrouvent à l’interface entre le plasma et le Ficoll. L’anneau contenant les CMN est délicatement aspiré et déposé dans un nouveau tube de 50mL. Les cellules sont lavées deux fois, par centrifugation dans du PBS.
Elles sont alors divisées en 2 populations afin de réaliser les 2 modalités de culture :
• Pour la culture des cellules selon la méthode dite « coatée », avant de transférer les cellules dans les plaques de culture, ces dernières sont traitées avec du sérum de veau (SVF). Pour cela, 2 ml de SVF sont déposés dans chaque puits pendant 30 minutes puis retirés. Les cellules sont ensuite ensemencées à une densité de 2 x 106 cellules / cm2 dans un milieu de culture contenant de l’α-MEM avec 10% SVF.
• Pour la culture des cellules selon la méthode dite « optimisée », les cellules
sont directement ensemencées à une densité de 10 x 106 cellules / cm2 dans un milieu avec 10% de SVF dans des plaques de 6 puits sans traitement préalable.
Quelle que soit la méthode de culture utilisée, les cellules sont laissées en culture pendant au moins 12 heures à 37˚C. Dès lors, le milieu de culture est
changé une fois par semaine pour la méthod
milieu tous les 3 jours pour la méthode « optimisée ».
Le culot cellulaire contenant la fraction de CMN est prêt à subir une séparation des différentes sous
l’isolement des CSH se communément dénommée 20) [129], [130].
Figure 19 : technique d’isolement des CMN
Balachandran, K. Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood. J. Vis. Exp
changé une fois par semaine pour la méthode « coatée » et remplacé à 50% du milieu tous les 3 jours pour la méthode « optimisée ».
Le culot cellulaire contenant la fraction de CMN est prêt à subir une séparation des différentes sous-populations cellulaires. La numération et fait le plus souvent grâce à la cytométrie en flux, communément dénommée : Fluorescence activated cell sorting (FACS) (figure
technique d’isolement des CMN. Ravishankar, P., Ze
Balachandran, K. Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood. J. Vis. Exp
e « coatée » et remplacé à 50% du Le culot cellulaire contenant la fraction de CMN est prêt à subir une populations cellulaires. La numération et fait le plus souvent grâce à la cytométrie en flux, : Fluorescence activated cell sorting (FACS) (figure
Ravishankar, P., Zeballos, M.A., Balachandran, K. Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human
.
Figure 20 : Principe de fonctionnement de la fluoro
La base d'une analyse FACS repose sur une suspension (colorée et) marquée de cellules individuelles soumise à un faisceau laser focalisé. Des forces capillaires poussent les cellules à franchir la cellule de flux, où les marqueurs sont stimulés par le rayonnement du laser. La lumière fluorescente émise par les fluorophores
détectées séparément. Tiré de www.bio
Principe de fonctionnement de la fluoro-cytométrie
La base d'une analyse FACS repose sur une suspension (colorée et) rquée de cellules individuelles soumise à un faisceau laser focalisé. Des forces capillaires poussent les cellules à franchir la cellule de flux, où les marqueurs sont stimulés par le rayonnement du laser. La lumière fluorescente émise par les fluorophores (combinés aux anticorps) et la lumière diffusée sont
Tiré de www.bio-rad-antibodies.com
cytométrie.
La base d'une analyse FACS repose sur une suspension (colorée et) rquée de cellules individuelles soumise à un faisceau laser focalisé. Des forces capillaires poussent les cellules à franchir la cellule de flux, où les marqueurs sont stimulés par le rayonnement du laser. La lumière fluorescente (combinés aux anticorps) et la lumière diffusée sont
L’International Society for Hematotherapy and Graft Engineering (ISHAGE) a standardisé le protocol permettant l’isolement des cellules CD34+ par cytométrie en flux [131]. Il s’agit d’une analyse multiparamétrique basée sur les paramètres morphologiques et immununophénotypiques que peuvent présenter les CSH ainsi que leurs progéniteurs.
En effet, la caractérisation phénotypique et la purification d'une population enrichie en cellules souches peuvent être réalisées grâce à différents marqueurs membranaires [127] :
•
L’antigène CD34 :
Le cluster de différentiation 34 a été l’un des tous premiers marqueurs membranaires caractérisant une population de CSH humaines et il est actuellement l’antigène le plus utilisé dans l’immunophénotypage.
Il s’agit d’une glycoprotéine transmembranaire fortement glycosylée de la famille des sailomucines, impliquée dans la localisation et l'adhérence des progéniteurs hématopoïétiques dans leur niche, la MO.
Lors de la différenciation hématopoïétique l'expression du CD34 est perdue. En culture les cellules CD34+ issues de sang de cordon, sont capables de s'autorenouveler et de se différencier en cellules matures de divers lignages notamment grâce à des combinaisons de cytokines adaptées [1]. Par ailleurs, il a été montré qu’une fraction de cellules présentant des caractéristiques souches n’exprimait pas le CD34 [132] et que l’utilisation du critère d’expression du CD34 pouvait entraîner l’exclusion d’une partie des CSH humaines.
Le CD34 est exprimé sur plusieurs compartiments de cellules hématopoïétiques et les CSH ne représentent qu’un très faible pourcentage des cellules CD34+. Ainsi d’autres marqueurs membranaires peuvent y être
• L’antigène CD90 :
très couramment utilisé comme marqueur des CSH en combinaison avec le CD34.
•
L’antigène CD45 :
confirme la nature hématopoïétique des cellules de l’USC [101], [102].•
L’antigène CD38 :
Le CD38 est un marqueur négatif des CSH. A l’inverse de l’antigène CD34, le CD38 n’est pas exprimé à la surface des CSH et son expression apparaît lors de la différenciation des cellules [135], [91].•
L’antigène CD133 : Le CD133 peut se substituer au CD34. Il est présent
à la surface des CSH humaines primitives et des progénitures neuronaux.•
L’antigène CD71 :
Le récepteur de la transferrine.•
L’antigène CD135 :
La stimulation du cluster 135 (Flt3) provoque des mécanismes anti-apoptotiques nécessaires pour maintenir la survie cellulaire [136] [137].•
Marqueur Lin- :
N’étant pas engagées dans un lignage en particulier, les CSH sont notamment caractérisées par l’absence de tous les marqueurs (Lin-). Ainsi ces marqueurs caractérisent les 10 lignages hématopoïétiques, on distingue : CD2, CD3, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD19, CD24, Cd56, CD66b, et glycophorine A.• HLA-DR :
permet une facilité de prise de greffe et une réduction de l’incidence de GVHD [138].•
La Capacité à expulser des fluorochromes,
tels que le Hoechst 33342 et la Rhodamine Rh -123(colorant fluorochrome supravital), est notamment considéré comme un procédé de purification [139] .Au décours de cette analyse immunophénotypique des CSH de l’USC ,sept populations de CS peuvent être identifiées , représentant ainsi des progéniteurs hématopoïétiques à différents stades de différenciation(figure) [140].
La CSH primitives, représente environ 1/30.000 des cellules nuclées de l’USC et possède le phénotype suivant: CD34+ CD38- CD45RAlow FLT3+ CD90low CD117low Rh low. Les progéniteures quant à eux, expriment des marqueurs immunologiques selon la voie de différenciation qu’ils ont empruntée. D'autres marqueurs, spécifiques cette fois, vont permettre de caractériser les différentes lignées : •
Lignée lymphocytaire T :
CD10 ; CD7 ; CD5 ; CD2 ; CD3 ; CD4 ; CD8. •Lignée lymphocytaire B :
CD10 ; CD19.• Lignée myéloïde :
CD13 ; CD33.•
Lignée mégacaryocytaire :
CD61 ; CD41 ; CD42b.•
Lignée érythrocytaire :
le marqueur classiquement utilisé pour cette lignée est le CD235 (également appelé Glycophorine A) qui apparaît lorsque le CD34 n’est plus exprimé la lignée myéloïde (CD33, HLA DR) ou lymphoïde (CD10, CD20).Figure 21 : De la cellule souche vers les lignées hématopoïétiques. Marqueurs phénotypique des lignées,
De la cellule souche vers les lignées hématopoïétiques. Marqueurs , D’après Muller, 2009.