Test plTALEs-VP64 in vitro

5.1.3.1 Les cellules fibroblaste des patients FRDA

Dans cette approche, 14 plTALEs-VP64 qui ciblent différentes séquences au niveau de la région régulatrice du gène FXN ont été construits. Ces plTALEs-VP64 ont été testés in vitro sur des fibroblastes du patient GM04078 (FRDA4078) (obtenues de l’Institut Coriell, Camden, New Jersey). Ces cellules contiennent 541/420 répétitions de GAA. Par la suite, les meilleurs plTALEs-VP64 ont été sélectionnés puis testés in vitro sur les fibroblastes de quatre différents patients : FRDA66 (240/640), FRDA162 (355/805), FRDA4675 (255/1140) et FRDA4743 (470/970). Les résultats de ces tests ont été comparés par rapport à l’activité transcriptionnelle du gène FXN dans des fibroblastes des personnes normales : NED29178 NED36091, NED36320 et NED34769 obtenues de l’Institut Coriell.

Les cellules FRDA et NED ont été cultivées dans un milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium de Wisent Inc., Saint-Jean-Baptiste, QC, Canada) avec 10 % de FBS (Gibco Inc., Burlington, Ontario), 1 % d’antibiotiques (la pénicilline et la streptomycine) (Gibco® by Life Technology Inc. #15140-122, USA) et 1 % de milieu Non-Essential Amino Acid 100X (NEAA, Wisent Bioproducts Inc, #321-011-EL, Canada) après incubation à 37 °C sous 5 % de CO2.

5.1.3.2 Nucléofection

Les cellules FRDA ont été électroporées à l’aide de la technologie de nucléofection Amexa (Les Produits Scientifiques ESBE , St-Laurent, QC) pour introduire le plasmide pCR3.1-plTALE-VP64 à l’intérieur des noyaux des cellules FRDA [62]. Nous avons utilisé pour cette technique 10 µg des plasmides plTALEs-VP64 et 100 µl de la solution de la nucléofection pour resuspendre 106 des cellules FRDA. Le mélange a été transféré dans une cuve pour l’électroporation avec un programme de P 022 (Fig. 35).

Les cellules traitées par plTALEs-VP64 pendant 2 ou 3 jours avec un changement de milieu chaque 24 h afin de les analyser par qRT-PCR et Western Blot. Pour évaluer l’effet de ces plTALEs-VP64 sur l’augmentation de la transcription et l’expression du gène FXN

49

par rapport aux deux contrôles négatifs des cellules nucléofectées juste par la solution de nucléofection (cellules non traitées) et des cellules traitées par le vecteur pCR3.1 qui n’expriment pas le plTALEs-VP64 (vecteur vide).

Figure 35: Le schéma de test in vitro des plTALEs-VP64 dans des cellules FRDA.

5.1.3.3 qRT-PCR

Cette technologie a pour but d’analyser l’effet des différents plTALEs-VP64 sur l’augmentation de la synthèse de l’ARNm du gène FXN et pour sélectionner les plTALEs-VP64 les plus efficaces pour cette approche. Nous avons quantifié le nombre de copies d’ARNm par une qRT-PCR. Par la suite, nous avons déterminé l’augmentation de l’activité transcriptionnelle du gène FXN normalisé par des gènes GAPDH et HPRT. Ce test a été réalisé en collaboration avec le centre génomique du CHU de Québec (Plate- forme de l'expression génétique, CHU de Québec, Québec). Les différentes amorces utilisées pour cette approche sont les suivantes :

Amorces FXN : AAG CCA TAC ACG TTT GAG GAC TA / TTG GCG TCT GCT TGT TGA TCA. Amorces GAPDH : TTG GCA TTG TGG AAG GGC TCA T / CGG CAC CCC TCT ACC CAA AAG. Amorces HPRT1 : CAG GAC TGA AAG ACT TGC TCG AGA T / CAG CAG GTC AGC AAA GAA CTT ATA GC. Amorces TALE : GAG TCG GTG TCA CAG AAC TCG AG / CGC CTG GTC AGG TGT CTG AGT TG.

5.1.3.4 Western blot

Après l’extraction d’ARNm via l’utilisation du TRIzol (pour quantifier l’ARNm par qRT- PCR), le reste d’extrait des cellules FRDA traitées par plTALEs-VP64 a pu être soumis à une extraction de protéines. Les protéines ont été précipitées par isopropanol à température ambiante et ont été lavées avec 0,3 M de guanidine hydrochloride et d’éthanol pur. Un tampon de resuspension (10% SDS, 0,25M Tris HCl, glycérol, - Mercaptoéthanol et le bleu de bromophénol) a été utilisé pour la dénaturation des

50

protéines à 100 °C pendant 5 min. La concentration des protéines a été quantifiée par le test à l’Amido black. Une quantité de 25-40 µg de protéines a été séparée sur un gel SDS- PAGE de concentration de 15 % pour la frataxine et de 9 % pour l’étude de la réponse immunitaire in vivo. Le transfert des protéines a été fait sur une membrane de nitrocellulose (BioRad Inc, Mississauga, Ontario). La membrane a été bloquée pendant une heure à température ambiante avec 0,1X PBS (13,7 mM NaCl, 0,27 mM KCl, 1 mM Na2HPO4 et 0,176 mM KH2PO4), 0,05 % de Tween et 5 % de lait.

Les différents anticorps primaires et secondaires ont été utilisés : l’anti-frataxine (#ab110328, Abcam Inc., Toronto, Canada) avec une concentration de 1/500 dans un tampon de 0,1X PBS, 0,05 % de Tween et 5 % de lait pendant la nuit à 4 °C. L’anti- GAPDH (Temecula Inc. #MAB374) avec une concentration de 1/30000 dans un tampon de 0,1X PBS, 0,05 % de Tween et 5 % de lait pendant la nuit à 4 °C. L’anti-ß actine (Sigma Inc., #A-1978, Markham, Ontario) avec une concentration de 1/10000 dans un tampon de 0,1X PBS, 0,05 % de Tween et 5 % de lait pendant la nuit à 4 °C. La présence d’anticorps contre les plTALE a été vérifiée dans les sérums des souris injectés par AAV- plTALE-TF. Ces sérums étaient dilués 1/250, dans un tampon de 0,1X PBS, 0,05 % de Tween et 5 % de lait. La réaction a duré toute la nuit à 4 °C. Un anti-Flag conjugué avec HRP (Sigma, #A85922MG, Markham, Ontario) avec une dilution de 1/15000 dans un tampon de 0,1X PBS, 0,05 % de Tween et 5 % de lait pendant la nuit à 4 °C. La membrane a été lavée 3 fois avec 0,1 % PBS et 0,05 % de Tween, 10 min pour chaque lavage à la température ambiante. L’anticorps secondaire utilisé était est un anticorps de souris anti- lapin dilué à 1/10000 dans un tampon de 0,1X PBS, 0,05 % de Tween et 5 % de lait pendant une heure à température ambiante. Après trois lavages par 0,1 % PBS et 0,05 % de Tween pendant 10 min pour chaque lavage, la membrane a été révélée en utilisant le kit de Clarity Western ECL Substrate (Bio-Rad Inc, Mississauga, Ontario) et un développeur pour visualiser les bandes des protéines. Ces derniers ont été quantifiés par le logiciel ImageJ.

5.2 Les vecteurs lentivirus