La construction plTALEs-VP64

La construction des plTALEs-VP64 se fait d’abord en deux grandes étapes par la méthode d’assemblage de Golden Gate pour produire plTALENs. Ces derniers contiennent le domaine nucléase FokI. Cette nucléase est ensuite remplacée par un VP64 au cours d’une troisième étape pour construire le plTALE-VP64 (Fig. 32).

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Figure 32: La présentation schématique pour les grandes étapes de la construction des plTALEs-VP64

(Adapté de [54]).

5.1.2.1 Première étape de la construction des plTALENs (pFUS2)

La première étape a pour but de regrouper chaque groupe de 4 RVD (50 ng/µl) successifs dans un seul plasmide pFUS2 (25 ng/µl) selon une réaction de Golden Gate. Elle nécessite deux enzymes, la Quick ligase et le BsaI-HF avec le tampon 10X T4 DNA ligase (New England Bioloabs Inc., Ipswich, MA, USA) dans une seule réaction de trois cycles (37 °C pendant 5 min, 16°C pendant 10 min). Elle a été suivie par une incubation à 50 °C pendant 30 min et à 80 °C pendant 5 min après l’addition de 0,25 µl de tampon 4, 0,25 µl de BSA 10X et 0,1 µl de BsaI-HF (Fig. 33). Le principe de cette réaction est de créer des séquences cohésives à chaque extrémité avec quatre paires de bases en chevauchement, rendu possible après la digestion par BsaI-HF. L’extrémité cohésive droite du premier module de RVD se chevauche avec l’extrémité cohésive gauche du module RVD suivant. L’extrémité cohésive gauche du premier insert (module 1 de RVD) et l’extrémité cohésive droite du dernier insert (module 4 de RVD) doivent se chevaucher avec les deux extrémités cohésives du vecteur pFUS2 digéré pour assembler les 4 modules des RVD. Le produit de cet assemblage a été amplifié dans des bactéries compétentes DH5 après une transformation par un choc thermique à 42 °C pendant 45 s et suivi par une incubation à 37 °C pendant une heure et une incubation à 37 °C pendant la nuit sur un milieu solide LB-Amp (100 µg/ml).

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Des colonies bactériennes ont été cultivées dans le milieu liquide LB-Amp (100 µg/ml) à 37 °C pendant la nuit. Ensuite, une extraction d’ADN plasmidique (le plasmide de l’assemblage contient des 4 RVD) a été faite par le Kit de ThermoFicher scientific GeneJET Plasmid Miniprep (#K0503). À la fin, une réaction PCR a été réalisée sur 50 ng de plasmide d’assemblage extrait, en utilisant les amorces pCR8_F1 : TTG ATG CCT GGC AGT TCC CT et pCR8_R1 : CGA ACC GAA CAG GCT TAT GT pour amplifier le fragment de 4 RVD dans pFUS2. L’amplification par PCR se fait avec l’enzyme de polymérase Phusion® High-Fidelity (New England Bioloabs Inc., Ipswich, MA, USA) à la température d’hybridation de 55 °C et à la température d’élongation de 72 °C pendant 15 s pour les deux. La PCR permet de sélectionner les bonnes constructions de l’assemblage de 4 RVD après une analyse de la taille attendue par une électrophorèse sur gel d’agarose 1%.

Figure 33: Le protocole de la réaction d’assemblage des 4 modules des RVD d’étape 1

(Https://www.addgene.org).

5.1.2.2 La deuxième étape de la construction des plTALENs

Cette étape a pour but de regrouper l’ensemble des séquences des RVD complémentaires à la séquence cible d’ADN dans un seul plasmide ptCMV-VR (50 ng/µl) qui contient le dernier RVD le treizième ou le quinzième, selon le principe de la réaction de Golden Gate. Elle permet d’assembler les groupes des RVD successifs (50 ng/µl) pour construire plTALENs. Cette étape nécessite deux enzymes, la Quick ligase et Esp3I (BsmB1) (New England Bioloabs Inc., Ipswich, MA, USA) dans une seule réaction de six cycles (37 °C pendant 5 min et 16 °C pendant 10 min). Elle a été suivie par une incubation à 37 °C pendant 60 min et 80 °C pendant 5 min après l’addition de 0,5 µl de tampon Tango, 0,5 µl de 10 mM DTT et 0,2 µl de Esp31 (BsmB1) (fig. 34). Pour créer des séquences cohésives de chaque extrémité avec quatre paires de bases en chevauchement après la digestion avec Esp3I. L’extrémité cohésive droite du premier module de 4 RVD 1ui se chevauche avec l’extrémité cohésive gauche du second module de 4 RVD. L’extrémité

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cohésive gauche du premier module de 4 RVD et l’extrémité cohésive droite du dernier module de 4 RVD doivent se chevaucher avec des deux extrémités cohésives du vecteur ptCMV-VR digéré pour construire un plTALENs.

Le produit de cet assemblage a été amplifié dans des bactéries compétentes DH5 après une transformation par un choc thermique à 42 °C pendant 45 s, suivit, par une incubation à 37 °C pendant une heure et une incubation pendant la nuit à 37 °C sur un milieu solide avec LB-Amp (100 µg/ml).

La sélection des bonnes constructions des RVD des plTALENs contenant 13 RVD ou 15 RVD a été faite selon la même procédure de sélection décrite dans la première étape c’est à dire avec l’utilisation des amorces de PCR de TALE-F : GAG CAC CCC TCA ACC TGA CCC CAG et de TALE-R : TCG AAA GCT GGG CCA CGA TTG. Le programme de PCR suit la cinétique 66 °C pendant 15 s (hybridation) et 72 °C pendant 50 s (élongation).

Les constructions finales des plTALENs ont été validées par un séquençage qui confirme la conformité des séquences nucléotides de plTALENs, cela fut possible grâce à 4 amorces:

T7p : TAA TAC GAC TCA CTA TAG G du côté 5’de N-ter

TALE-F : GAG CAC CCC TCA ACC TGA CCC CAG du côté 5’des RVD TALE-R : TCG AAA GCT GGG CCA CGA TTG du côté 3’des RVD BGH : TAG AAG GCA CAG TCG AGG du coté 3’ du FokI

Figure 34: Le protocole de la réaction d’assemblage finale de l’ensemble des RVD dans un vecteur ptCMV afin de construire plTALENs

(https://www.addgene.org).

5.1.2.3 La construction des plTALEs-VP64

Nous avons utilisé deux clonages pour construire les plTALEs-VP64 à partir des plTALENs (contenant la nucléase Fok1). Le plTALE-VP64 a été fait dans un plasmide pCR3.1 qui contient un promoteur CMV et un gène de résistance Amp.

47 5.1.2.3.1 Le clonage In-fusion

Le premier clonage avec un clonage In-fusion a pour but d’introduire un insert VP64- XbaI dans les régions 3’ C-ter des constructions plTALENs. Nous avons utilisé le kit In- Fusion Cloning technology (Clontech Laboratories Inc, Mountain View, États-Unis) pour faire la construction plTALENs-VP64-Xba1. Tout d’abord, le vecteur plTALENs a été linéarisé par BamHI et le fragment d’insert VP64-XbaI a été amplifié par des amorces TALE-VP64-F : ACC AAC AGA AGG ATC CCC GAG AGG ACA et TALE-VP64-R : GTC CTC TCG GGG ATC CAC AGT CGA GGC T. Par la suite, une réaction de ligation a été faite sur une concentration d’ADN (insert + vecteur) de 1-10 ng/µl avec un ratio 3 : 1 d'insert/vecteur. Nous avons utilisé 2 µl d’enzyme d’In-fusion et nous avons complété le volume final à 10 µl avec l’eau. La réaction de clonage In-fusion a été incubé à 50 °C pendant 25 min. Les produits de cette réaction ont été utilisés pour transformer les bactéries compétentes Stellar fournies avec le Kit. La transformation a été faite par un choc thermique à 42 °C pendant 45 s plus une incubation à 37 °C pendant une heure, et une incubation pendant la nuit à 37 °C sur un milieu solide avec LB-Amp 100 µg/ml. La sélection des constructions plTALENs-VP64-XbaI a été faite par une réaction de PCR avec les amorces, TALE-VP64-F et TALE-VP64-R et un programme de 60 °C pendant 20 s (hybridation) et de 72 °C pendant 30 s (élongation).

5.1.2.3.2 La construction finale de plTALEs-VP64

Le deuxième clonage est pour construire plTALEs-VP64 dans un vecteur de pCR3.1 (Addgene Inc, Cambridge, Ma, USA). Cette réaction a été faite par une double digestion MluI/XbaI (New England Bioloabs Inc., Ipswich, MA, USA) qui permet de cloner un insert Mlu1-TALE-VP64-Xba1 de taille de 657 pb dans le vecteur pCR3.1 qui contient le promoteur CMV et un gène de résistance Amp. Le vecteur et l’insert ont été purifiés par gel extraction (Thermo Scientific GeneJET Gel Extraction Kit #K0691) et ont été liés avec l’enzyme Quick ligase. Le produit de ligation a été utilisé pour transformer des bactéries compétentes DH5 par un choc thermique à 42 °C pendant 45 s, plus une heure d'incubation sous l'agitation à 37 °C et enfin une incubation à 37 °C pendant la nuit sur un milieu solide de LB-Amp (100 µg/ml).

La sélection des clones positifs qui contiennent les bonnes constructions plTALEs-VP64 se fait par une double digestion et un séquençage. La double digestion a été faite par MluI/XbaI à 37°C pendant deux heures. Le séquençage qui confirme les séquences correctes des nucléotides des plTALEs-VP64 a été fait par 4 amorces :

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T7p : TAA TAC GAC TCA CTA TAG G du côté 5’de N-ter

TALE-F : GAG CAC CCC TCA ACC TGA CCC CAG du côté 5’des RVD

TALE-R : TCG AAA GCT GGG CCA CGA TTG du côté 3’des RVD BGH : TAG AAG GCA CAG TCG AGG du coté 3’ du VP64