La construction plTALEs-SunTag10X et plTALE-SunTag24X

Les résultats précédents ont montré que les effecteurs plTALE-VP64 avec 15 RVD, qui ciblent les séquences 6-15, 8-15 et F4-15 et qui sont insérés dans le pCR3.1 qui contient le promoteur CMV, induisent le gène FXN environ le double dans les cellules de FRDA. C’est pourquoi nous avons essayé un nouveau système qui utilise tous les avantages de plTALE-VP64 mentionnés auparavant, mais à l’aide de 10 ou de 24 VP64 au lieu d’un seul VP64, nous avons donc produit des plTALE-SunTag10X (plTALE-ST10X) et des plTALEs-SanTag24X (plTALE-ST24X).

Nous avons construit plusieurs pCR-3.1-plTALE-ST10X et pCR-3.1-plTALE-ST24X (Fig. 65 A) (Tableaux 7 et 8) qui expriment le plTALE-ST10X et plTALE-ST24X, et nous avons produit un pCR3.1-scFV-SpGFP-Vp64-GB1-NLS qui exprime le scFV- spGFP-VP64 (Fig. 65 B). Cette protéine scFV-spGFP-VP64 se lie avec le ST qui est fusionné avec les plTALEs pour induire le gène FXN. Les plTALE-ST10X et plTALE- ST24X peuvent recruter respectivement 10 et 24 VP64 selon le nombre d’épitopes ST fusionnés avec le plTALE qui ciblent le gène FXN. Des vecteurs pRC3.1-plTALEs- StuI/XbaI (13 RVD) et pRC3.1-plTALEs- RsrII\XbaI (13 RVD) et des inserts ST10X- StuI/XbaI et ST24- RsrII/XbaI ont été purifiés après une digestion enzymatique pour faire des clonages des premières constructions plTALE-ST10X et plTALE-ST24X. Les tailles des fragments ont été analysées sur un gel d’agarose 1% pour chaque produit de double digestion. Nous avons ainsi obtenu les fragments de 7584 pb pour pRC3.1-plTALEs-

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StuI/XbaI (13 RVD), de 743 pb pour l’insert ST10X- StuI/XbaI, de 7592 pb pour les vecteurs pRC3.1-plTALEs- RsrII\XbaI (13 RVD) et 1773 pb pour l’insert ST24- RsrII\XbaI. Des réactions de ligation ont été faites pour faire les premières constructions de pCR3.1-plTALE-ST10X (13 RVD) et de pCR3.1-plTALE-ST24X (13 RVD). Les constructions ont été validées par le séquençage avec 4 amorces, T7p, TALE-F, TALE- R et BGH (Fig. 65 A) qui permettent de séquencer 4 fragments de la construction plTALE-ST. Ces constructions validées ont été utilisées pour faire le reste des plTALE- ST10X et plTALE-ST24X par un clonage après une double digestion avec deux enzymes MluI/PflMI pour remplacer les plTALEs spécifiques pour chaque séquence cible dans la construction initiale de plTALE-ST. Le séquençage par 4 amorces a été utilisé pour valider les constructions de pRC3.1-plTALE-ST sélectionnées après ces clonages (un exemple de séquençage de plTALE-ST10X-8-13 par T7p, TALE-F, TALE-R et BGH est illustré dans la Fig. 66. Parallèlement, la construction pCR3.1-scFV- SpGFP-Vp64-GB1- NLS a été effectuée par un clonage après une double digestion par EcoRI/NotI. Ce clonage a été fait dans un vecteur de pCR3.1 digéré (EcoRI/NotI) et purifié (fragment de 5017 pb) et avec un insert purifié de 2061 pb obtenu après une digestion enzymatique par les mêmes enzymes. Ces fragments (le vecteur + l’insert) ont été utilisés pour faire la construction finale qui a été validée par le séquençage avec deux amorces T7p et BGH.

Figure 65: La structure moléculaire de plTALE-ST10X/24X

A) La structure de pCR3.1-plTALE-ST exprime le plTALE fusionné avec 10 ou 24 épitopes SunTag (ST) qui recrutent les scFV-sfGFP-VP64. B) La structure moléculaire de scFV- sfGFP- VP64-GB1-NLS qui exprime le spGFP-VP64 qui se lie avec ST pour activer le gène FXN. Nous avons construit au total 12 différents plTALEs-ST. Quatre d’entre eux contiennent 13 RVD et 10 ST (i.e., plTALE-ST10X) et ciblent les séquences 6, 7, 8 et 10 (plTALE- ST10X-6-13, plTALE-ST10X-7-13, plTALE-ST10X-8-13et plTALE-ST10X-10-13). Quatre autres contiennent 15 RVD et 10 ST (i.e., plTALE-ST10X) et ciblent les séquences 6, 7, 8 et F4 (plTALE-ST10X-6-15, plTALE-ST10X-7-15, plTALE-ST10X- 8-15 et plTALE-ST10X-F4-15) (Tableau 7). De plus 4 autres plTALEs-ST contiennent 13 ou 15 RVD et 24 ST et ciblent les séquences 6 et 8 (i.e., plTALE-ST24X-6-13,

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plTALE-ST24X-6-15, plTALE-ST24X-8-13 et plTALE-ST24X-8-15) (Tableau 8). Nous avons utilisé ces systèmes plTALEs-ST pour traiter les cellules FRDA4078 in vitro par nucléofection, afin, d’analyser le taux de la transcription et de l’expression du gène FXN des cellules FRDA4078 traitées par ces effecteurs plTALEs-ST. Par la suite, nous nous sélectionné les meilleurs plTALEs-ST pour induire l’expression du gène FXN pour des tests supplémentaires sur d’autres cellules FRDA in vitro et sur le modèle de souris YG8R in vivo.

Tableau 7: La liste des plTALEs-ST10X.

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Figure 66: Le résultat de séquençage pCR3.1-plTALE-ST10X-4-13 avec 4 amorces.

6.5.2 Traitement in vitro des cellules FRDA4078 par le système de plTALE-ST

Nous avons traité les cellules FRDA4078 par ces nouveaux plTALEs-ST pendant 2 jours pour analyser leurs effets sur l’activité de la transcription et l’expression du gène FXN. Les effets des plTALEs-ST ont été normalisés par rapport aux gènes GAPDH et HPRT et par rapport aux contrôles négatifs (les cellules non traitées et les cellules traitées par le vecteur qui exprime scFV plus le vecteur pCR3.1 vide) (Fig. 67). Les résultats montrent que les plTALEs-ST10X sont meilleurs que les plTALEs-ST24X. Ces derniers augmentent la transcription du gène FXN dans les cellules FRDA4078 au maximum 2 fois pour le plTALE-ST24X-6-15 (augmentation significative). Au contraire, les plTALEs-ST10X qui ciblent les régions 6-15 et 8-15 sont très efficaces. Ils augmentent l’activité transcriptionnelle du gène FXN dans ces cellules FRDA4078 plus que plTALEs-ST24X. On constate une augmentation significative de plus de 5 fois par le plTALEs-ST10X-6-15 et plTALEs-ST10X-8-15 (n = 6) normalisés par GAPDH et HPRT et par rapport aux contrôles négatifs. Ces résultats confirment aussi que les plTALE- ST10X avec 15 RVD ciblant les séquences 6 et 8 sont plus efficaces que les 13 RVD qui ciblent ces mêmes séquences pour augmenter l’activité transcriptionnelle du gène endogène FXN dans les cellules FRDA4078. Ces 2 meilleures plTALEs-ST10X augmentent aussi l’expression de la protéine frataxine dans ces cellules FRDA4078 traitées pendant deux jours. Cette augmentation est de 3 fois dans des cellules traitées par des plTALEs-ST10X-6-15 et plTALEs-ST10X-8-15 et de 2 fois dans des cellules traitées par plTALEs-ST10X-8-13 normalisé par GAPDH et par rapport au témoin. Les 4

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plTALEs-ST24X et plTALEs-ST10X-7-13 n’augmentent pas l’expression de la protéine frataxine dans les cellules FRDA4078 (Fig. 68).

Figure 67: L’induction de l’activité du gène FXN des cellules FRDA4087 par les plTALEs- ST10X et plTALEs-ST24X normalisée par GAPDH et HPRT et par rapport aux témoins.

Les plTALEs-ST24X augmentent l’activité du gène FXN dans les cellules FRDA4078 environ 2 fois par le plTALE-6-15 normalisé par GAPDH (*** p value = 0,0004) et HPRT (** p value = 0,0349). Les plTALEs-ST10X induisent la transcription du gène FXN plus que 5 fois par plTALE-ST10X6-15 (**** p value ˂ 0,0001) et plTALE-ST10X (*** p value = 0,0001) normalisé par GAPDH.

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Figure 68: Le taux d’expression de la frataxine dans les cellules traitées par plTALEs- ST10X et plTALEs-ST24X normalisé par GAPDH et par rapport au contrôle.

6.5.3 L’effet synergique des plTALEs-ST10X et plTALEs-ST24X sur