La compréhension de la pathogenèse moléculaire de FRDA a contribué au développement des différentes approches thérapeutiques, qui visent l’augmentation de l’expression de la protéine frataxine. Pour ce même objectif, nous avons utilisé la thérapie génique pour augmenter l’expression de la protéine frataxine en utilisant le système plTALE-FT [47] [57] [74] [75]. Ce dernier contient des facteurs d’activation de la transcription (VP64 ou p300) fusionnés avec des protéines de liaison à l’ADN plTALE qui ciblent la région régulatrice du gène FXN. Nous avons testé cette approche in vitro afin d’identifier le système plTALE-FT le plus efficace avant de passer aux tests précliniques in vivo.
Les TALEs-FT ont une grande utilité pour augmenter l’expression des gènes endogènes [76]. Pour cette raison, nous avons donc utilisé les plTALEs-FT pour activer le gène FXN in vitro dans des fibroblastes de patients FRDA. Les plTALEs sont caractérisés par 4 variations d’acides aminés dans leurs RVD et par une technique efficace d’assemblage en 4-modules RVD (Fig. 39, 40 et 41) [54] [55]. Nous avons utilisé le domaine activateur transcriptionnel VP64 fusionné avec un plTALE pour activer le gène endogène FXN [47] (Fig. 46A). Nous avons ciblé 14 séquences au niveau de la région régulatrice de ce gène (Fig. 37 et 40), des séquences cis et des séquences qui ne fixent pas les facteurs trans au niveau de site de l’initiation de la transcription.
Dans la première partie nous avons construit dans le vecteur pRC3.1 14 plTALEs-VP64 ciblant des séquences du gène FXN (Tableau 3). Ces différents plTALE-VP64 ont été testés sur les cellules FRDA pour induire la transcription et l’expression de la FXN. Le traitement des cellules FRDA a été fait par nucléofection. Cette technique permet de transfecter l’ADN dans plus de 90% des cellules [62] (Fig. 47).
Les résultats de ce traitement montrent que les plTALEs-VP64 qui ciblent les séquences entre les deux sites SFR et TFAP2 et la séquence qui cible EGR3, activent très bien la transcription du gène FXN dans les cellules FRDA (Fig. 48). Chapdelaine, P. et al en 2013 [33] ont démontré que le TALE-VP64 contenant 13 RVD et qui ciblait la séquence 8 (située entre les sites SFR et TFAP2) activait le gène FXN dans les cellules FRDA. Les plTALEs-VP64 avec 15 RVD activent l’expression de la FXN plus que les TALE-VP64 et les plTALEs-VP64 avec 13 RVD qui ciblent les mêmes séquences [45]. Les plTALEs-
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VP64 qui ciblent les séquences 6-15, 8-15 et F4-15 augmentent la transcription et l’expression de la FXN plus que de 2 fois par rapport aux contrôles négatifs (Fig. 48 et
49). Les meilleurs plTALEs-VP64 (plTALE-6-15, plTALE-8-15 et plTALE-F4-15) ont
un faible effet synergique sur l’augmentation de la transcription du gène FXN [74] [75].
Miller et al. ont été démontré qu’il est possible d’augmenter l’affinité des TALEs pour une séquence de nucléotides en mutant l’acide aminé en position 12 des RVD des TALEs [64]. Cependant, cette approche n’a pas produit des effets bénéfiques dans mes expériences! En effet mes résultats démontrent que ces nouveaux RVD ont diminué l’efficacité des plTALE-VP64 (Fig. 59) qui induisent l’activité du gène endogène FXN dans les cellules FRDA comparativement à l’utilisation des plTALE-VP64 avec les RVD normaux.
D’autre part, il est possible d’augmenter l’efficacité des plTALE-VP64 par l’utilisation des lentivirus qui expriment ce gène sous le control d’un promoteur EF1. Ces lentivirus qui expriment les plTALE-6-15 et plTALE-F4-15 ont un effet non-significatif sur la transcription de gène FXN. Par contre, le lentivirus codant pour le plTALE-8-15 a induit une faible augmentation de l’expression de la protéine frataxine (Fig. 55 et 56). Ces résultats démontrent que les plTALEs-VP64 exprimés par les lentivirus sont moins efficaces que les plTALEs-VP64 exprimé par le vecteur pCR3.1 sous le control du promoteur CMV. Ces derniers induisent une plus forte augmentation de la transcription et de l’expression du gène FXN dans les cellules traitées [33].
Par la suite, nous avons testé un autre domaine activateur, le p300, fusionné avec des protéines plTALEs (plTALE-p300) (Fig. 60). Ces derniers ciblaient les mêmes séquences actives sélectionnées auparavant avec les plTALEs-VP64 (Tableau 6). Des cellules FRDA4078 ont été nucléofectées in vitro avec le plasmide codant pour plTALE-p300. De plus, nous avons aussi vérifié s’il y avait un effet synergique entre plTALEs-VP64 et plTALEs-p300 et entre plusieurs plTALEs-p300 ensemble. Ces traitements ont démontré que les effecteurs plTALEs-p300 sont moins efficaces que les effecteurs plTALEs-VP64 qui ciblent les mêmes séquences contrairement à ce qui a été rapporté par Hilton et al [65]. En effet, les plTALEs-p300-6-15 et plTALE-p300-8-15 ont augmenté l’activité transcriptionnelle du gène FXN respectivement par seulement 1,2 et 1,5 fois comparativement avec les plTALEs-VP64-6-15 et plTALE-VP64-8-15 qui ont produit des augmentation plus que 2 fois (Fig. 62). La combinaison des effecteurs plTALEs-
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VP64 et plTALEs-p300 n’a pas activé la transcription du gène FXN par rapport à l’effet d’un seul plTALE-VP64 et par rapport aux contrôles négatifs, contrairement à ce qui a été montré par Anthony et al [74] pour l’activation du gène IL-2 par l’effet synergique des effecteurs TBP-TALE et VP64-TALE dans les cellules 293FT. Cependant, le traitement des cellules avec deux plTALEs-p300 qui ciblent les séquences 6-15 et 8-15 dans les cellules FRDA4078, augmente la transcription et l’expression du gène FXN environ 2 fois (Fig. 63 et 64) [65]. Ce qui suggère que l'acétylation de la chromatine ne se produit qu’avec l’utilisation de deux plTALEs-p300 en même temps. Ce résultat est l’équivalent de l’effet d’un seul plTALE-VP64 qui cible 6-15, 8-15 ou F4-15. Donc le traitement des cellules FRDA par effecteurs plTALEs-VP64 est plus efficace que le traitement par plTALEs-p300.
Ces résultats établissent que les effecteurs plTALE-VP64 exprimés par promoteur CMV dans le vecteur pCR3.1, sont un outil puissant pour induire le gène endogène FXN. Cela peut être dû à des différences dans la structure et la fonction des protéines VP64 et leur interaction avec le complexe transcriptionnel du gène FXN [45] [47] [48]. Ces effecteurs sont efficaces lorsque les plTALEs ciblent les séquences spécifiques au niveau de l’initiation de la transcription 6-15 ou 8-15 et la séquence qui cible le site de facteur de la transcription EGR3.
L’objectif d’améliorer cette technologie plTALE-VP64 pour traiter les cellules FRDA in vitro nous permet d’exploiter encore plus l’effet de ces effecteurs dans le but d’augmenter encore plus l’activité du gène endogène FXN. Pour cela, nous avons utilisé le système plTALEs-SunTag qui cible les séquences actives de la région régulatrice du gène FXN avec les 10 ou 24 VP64 recrutés par le SunTag qui est fusionné avec un seul plTALE (Fig. 65). Nos résultats montrent que le système transcriptionnel plTALE-SunTag peut activer fortement l'expression du gène endogène en utilisant un seul plTALE-ST10X. Une observation similaire a été faite par le groupe Tanenbaum et al avec une protéine dCas9 fusionnée avec un SunTag et un ARNg ciblant le promoteur du gène CDKN1B [66]. Les plTALEs-ST10X-6-15 et plTALEs-ST10X-8-15 permettent d’augmenter l’activité transcriptionnelle du gène FXN de plus que 5 fois (Fig. 67) et l’expression de la protéine frataxine d’environ 3 fois (Fig. 68) dans les cellules FRDA4078 par rapport aux contrôles négatifs. D’une autre façon, Haivan Ji et al. [77] a été montré une augmentation d’environ 27 fois de l’expression du gène reporteur luciférase avec le dCas9-SunTag24X. Cependant, l’effet synergique de ces effecteurs plTALEs-ST10X active le gène endogène
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FXN dans les cellules FRDA encore plus (Fig. 69). Cette activation de l’activité transcriptionnelle dépasse 10 fois dans les cellules FRDA4078 et est plus que 6 fois pour l’expression de la protéine frataxine. Par contre les plTALEs-ST24X et certaines plTALEs-ST10X avec 13 et 15 RVD qui ciblent des séquences non actives au niveau du promoteur et la séquence EGR3 n’ont pas un grand effet sur l’activité du gène endogène FXN par rapport aux deux effecteurs cités auparavant et par rapport aux contrôles négatifs. L’utilisation un seul effecteur plTALEs-ST10X qui cible le séquence 6-15 ou 8- 15 et recrute 10 VP64, induise la transcription du gène FXN après le recrutement le complexe transcriptionnel à l’aide les 10 VP64[45] [47] [48] [56] [66]. L’utilisation 2 plTALEs-ST10X qui ciblent deux régions actives au niveau du site d’initiation de la transcription permet de recruter un total de 20 VP64 ce qui permet d’avoir une activation puissante de l’expression du gène endogène FXN [66] [74] [75] [77].
La validation de ces effecteurs plTALEs-VP64 et plTALEs-ST10X comme un traitement efficace in vitro contre la maladie de FRDA a été effectuée avec des cellules de différents patients FRDA qui contiennaient un nombre différent de répétitions du triplet GAA. Ces cellules FRDA66, FRDA162, FRDA4675 et FRDA4743 contiennent respectivement des nombres de répétitions GAA de 240/640, 355/805, 255/1140 et 470\970. Les résultats ont démontré que les effecteurs plTALEs-VP64 activent la transcription environ 2 fois dans toutes les cellules FRDA même dans les cellules ayant un grand nombre de répétitions de GAA (255/1140 et de 470/970) (Fig. 50 et 51). Ainsi, dans les 4 patients FRDA avec des répétitions différentes, les plTALEs-ST10X ont augmenté fortement l'expression du gène FXN en utilisant un seul effecteur ou l’effet synergique de deux effecteurs plTALEs- ST10X-6-15 et plTALEs-ST10X-8-15 (Fig. 70, 71 et 72). Les plTALEs-ST10X-6-15 ont activé la transcription du gène FXN dans FRDA66, FRDA162, FRDA4675 et FRDA4743 par; 5,5 fois, 3 fois, plus que 4 fois et 4 fois, respectivement [66] [77]. Les plTALEs- ST10X-8-15 ont activé la transcription du gène FXN dans FRDA66, FRDA162, FRDA4675 et FRDA4743 par 4 fois, 3,5 fois, plus que 4 fois et 3,5 fois, respectivement [66] [77]. L’augmentation de l’activité transcriptionnelle du gène FXN est très forte dans les cellules qui ont été traitées avec les deux effecteurs plTALEs-ST10X-6-15 et plTALEs-ST10X-8-15 en même temps. Cette forte activation a augmenté la transcription du gène FXN 14,5 fois, 10 fois, 19 fois et 12 fois respectivement dans les cellules FRDA66, FRDA162, FRDA4675 et FRDA4743, ainsi que l’expression de la protéine frataxine qui a été augmentée plus que 12 fois dans FRDA4675. Donc le système
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plTALEs-ST10X est un système puissant qui permet de réguler l’expression du gène endogène FXN dans différents cas de FRDA [66] [74] [75] [77].
L’observation microscopique des cellules FRDA4078 en culture ayant été traitées par deux effecteurs plTALE-ST10X-6-15 et plTALE-ST10X-8-15 en même temps, permet de démontrer un marquage fluorescent due à la présence du GFP fusionné au scFV-VP64 (Fig. 73 et 74) [66]. Ce signal démontre que les plTALEs-ST10X s’attachent au promoteur du gène FXN et recrutent de 20 protéines scFV-VP64-GFP.
Dans le but de démontrer l’amélioration du phénotype biochimique des cellules FRDA4078 in vitro, un test d’aconitase a été effectué sur des cellules traitées en même temps avec deux effecteurs : plTALE-ST10X-6-15 et plTALE-ST10X-8-15. L’activité d’aconitase est en effet contrôlée réversiblement par le niveau de la frataxine dans la mitochondrie. Ce test a démontré que l’activité d’aconitase augmente significativement dans ces cellules traitées par ces effecteurs par rapport aux contrôles négatifs (les cellules non traitées et les cellules traitées par le pCR3.1-scFV et le pCR3.1 vide) (Fig. 76). Khonsari et al., [71] ont aussi démontré que l’activité aconitase augmente 2 fois dans les fibroblastes FRDA traités avec des lentivirus qui expriment la protéine frataxine in vitro. Donc, nos résultats démontrent que la transcription du gène endogène FXN dans les cellules FRDA est augmentée par les effecteurs plTALE-VP64 et plTALE-ST10X qui ciblent des séquences spécifiques au niveau de la région régulatrice du gène FXN. Cette augmentation du niveau la protéine frataxine permet de rétablir le phénotype biochimique normal dans les cellules FRDA tel que démontré par l’augmentation de l’aconitase dans ces cellules traitées par ces effecteurs.
En résumé cette application de la technologie plTALE-FT sera particulièrement importante pour réguler l’activité transcriptionnelle dans le cas FRDA. Elle peut être une approche très prometteuse pour traiter la maladie de FRDA par l’induction du gène endogène FXN ainsi que l’augmentation de l’expression de la protéine frataxine chez les patients de FRDA. Cette approche thérapeutique pourra aussi être utilisée pour de nombreuses autres maladies héréditaires dues à des haplo-insuffisances.
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Chapitre 8 : Conclusion et perspective
Dans ce projet, nous avons obtenu des résultats in vitro intéressants qui nous permettent d’exploiter les technologies plTALEs-VP64 et plTALEs-ST10X comme une approche thérapeutique. Ces derniers pourraient être particulièrement utiles pour traiter la maladie FRDA. Cette approche thérapeutique a pour but d’augmenter la transcription du gène FXN, et augmenter ainsi l’expression de la protéine frataxine dans un but ultime de rétablir l’activité métabolique de la mitochondrie dans les cellules des patients FRDA. Les protéines de liaison à l’ADN plTALEs qui ciblent des régions importantes d’initiation de la transcription du gène endogène FXN sont fusionnées directement avec les domaines activateurs VP64 ou avec le système SunTag qui permet de recruter 10 VP64 augmentant ainsi l’activité transcriptionnelle du gène FXN in vitro dans différentes cellules FRDA. Cette augmentation transcriptionnelle permet d’augmenter l’expression de la protéine frataxine dans ces cellules. Ce qui permet d’augmenter l’activité de l’enzyme aconitase dans les cellules traitées par le système plTALEs-ST10X. Ces démonstrations in vitro sont des preuves du rétablissement de l’activité normale des mitochondries dans les cellules FRDA traitées.
Ces résultats in vitro nous permettront de tester prochainement ces effecteurs in vivo sur les souris YG8R qui sont un modèle de la maladie FRDA [34] [36]. Les tests in vivo seront effectués avec l’utilisation des vecteurs de livraison AAV9 qui expriment les meilleurs effecteurs plTALE-VP64 et plTALEs-ST10X sélectionnés dans les tests in vitro. Ce test va nous permettre de valider l’efficacité de ces effecteurs in vivo pour traiter des souris modèles YG8sR avant de passer aux tests cliniques pour valider cette approche thérapeutique contre la maladie FRDA chez l’Homme. Avant de passer aux tests cliniques, une étude des effets hors cibles (off-target) des plTALEs-FT sera nécessaire. Cette étude pourra utiliser entre autres les techniques RNA-Seq et ChiP-Seq.
Cette technologie plTALEs sera utile pour activer un ou plusieurs gènes dans des maladies héréditaires. D’autre part, en remplaçant le VP64 dans le KRAB [48] elle pourrait être au contraire un moyen de réduire l’expression d’un ou de plusieurs gènes. Cette technologie pourra aussi être utile pour mieux comprendre le rôle de plusieurs gènes.
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