Les pAAV-plTALEs-VP64 et ST

Les meilleurs plTALEs-FT sélectionnés auparavant qui ciblent des séquences spécifiques au niveau de site d’initiation de la transcription du gène FXN ont été testés in vivo, afin de valider l’efficacité de ces meilleurs effecteurs plTALEs-FT in vivo sur des souris modèles YG8R nous avons utilisé des AAV9 comme vecteurs de livraison des plTALEs in vivo. Les vecteurs AAV9 les plus utilisées dans les essais de thérapie génique, fourni une expression systémique stable et à long terme dans la plupart des tissus tel que le cœur et le cerveau grâce au sérotype 9 [34].

6.6.1 Les pAAV-plTALEs-VP64

Les Constructions pAAV-plTALEs-VP64 ont été faites dans un vecteur pAAV_TALE- TF(VP64) -BB_V3 par un clonage après une double digestion avec 2 enzymes de restriction MluI/NheI. La digestion enzymatique donne un vecteur pAAV de 4651 pb et un insert plTALE de 2051 pb qui servent pour faire la construction finale pAAV-plTALE- VP64.

Les constructions positives ont été validées par la digestion enzymatique et un séquençage avec 4 amorces. Les résultats de ce dernier correspondent aux séquences nucléotides attendues de chaque construction pAAV-plTALE-6-15, pAAV-plTALE-8-15 et pAAV- plTALE-F4-15. Ces derniers ont été utilisés pour la production des virus AAV9 qui expriment plTALE-6-15, plTALE-8-15 et plTALE-F4-15.

96 6.6.2 Les pAAV-plTALEs-ST10X

Nous avons produit deux types de constructions pAAV-plTALEs-ST10X-6-15 ou pAAV-plTALEs-ST10X-8-15 et pAAV-scFV-SpGFP-VP64-GB1-NLS (pAAV-scFV) pour faire le système de pAAV-SunTag. Les pAAV-plTALEs-ST10X ont été faits par un clonage avec le vecteur pAAV de taille 5433 pb et les inserts plTALE-6-15 ou plTALE- 8-15 de taille 1892 pb. Le vecteur et les inserts ont été produits par une double digestion avec les enzymes de restrictions MluI/PflMI. La construction pAAV-scFV a été faite par le clonage In-fusion avec de vecteur pAAV digéré par BamHI/MluI de taille 3966 pb et l’insert amplifié par PCR de taille 2060 pb. Les clones positifs ont été validés par les séquençages avec quatre amorces pour les pAAV-plTALEs-ST10X et avec 2 amorces pAAV-scFV qui permettent de valider les bonnes constructions avec les bonnes séquences nucléotides attendues.

6.6.3 Traitement des cellules FRDA4078 par pAAV-plTALEs-ST10X

Les pAAV-ST10X ont été testés in vitro sur des cellules FRDA4078, afin de tester l’efficacité de ces effecteurs exprimés par le pAAV qui contient le promoteur CAG. Ce test a été fait par nucléofection avec 10 µg d’ADN (6 µg de pAAV-plTALE-ST10X plus 4 µg de pAAV-scFV) et incubation pendant 2 jours à 37 ºC. Le traitement a été fait par rapport aux contrôles négatifs (les cellules non traitées et les cellules traitées par le vecteur pAAV vide plus le pAAV-scFV) et par rapport au plTALE-ST10X exprimé par les pCR3.1 avec le promoteur CMV.

Dans le système SunTag, le plTALE-ST10X recrute 10 de sfGFP-VP64 ce qui donne un marquage fluorescent grâce à leur signal extrêmement intense. Ce dernier peut-être une étiquette lumineuse qui permet de confirmer le ciblage de chaque plTALE.

L’observation par microscopie des noyaux des cellules traitées par ce système permet de révéler un marquage qui est beaucoup plus lumineux dans le locus génomique ciblé par plTALE-ST10X après le recrutement de 10 sfGFP-VP64 par rapport au contrôle négatif traité avec un vecteur qui n’exprime pas le plTALE et un vecteur qui exprime sfGFP- VP64 (Fig. 73). Le GFP de ce dernier s’exprime normalement dans le noyau et le cytoplasme et il ne contient pas l’étiquette lumineuse.

97

Figure 73: Les noyaux des cellules FRDA4078 traitées par pAAV-plTALEs-ST10X.

A) le contrôle négatif ; les cellules traitées par un vecteur pAAV qui n’exprime par le plTALE plus un pAAV-scFV, le vert de GFP est normal il contient pas l’étiquette lumineuse. B) Les noyaux des cellules FRDA4078 traitées avec plTALE-ST10X-6-15. Ils contiennent des étiquettes plus lumineuses des locus ciblés par plTALE-ST10X après le recrutement de scFV-sfGFP.

Figure 74: Les cellules FRDA4078 traitées par plTALE-ST10X.

En haut, les cellules FRDA4078 traitées par pAAV-plTALEs-ST10X-6-15 plus 8-15, le signal de GFP se localise au niveau de locus ciblés par plTALEs qui fixent 10 GFP-FV64 par chaque plTALEs (un total de 20 GFP-VP64) pour construire l’étiquette lumineuse. En bas, les cellules FRDA4078 traitées par pCR3.1-plTALEs-ST10X-6-15 plus 8-15 les étiquettes plus lumineuses des loci ciblés par les effecteurs qui recrutent 20 GFP-VP64 (la forte intensité du signal lumineux est due à l’expression de GFP-VP64 par le promoteur CMV).

98

Le traitement in vitro des cellules FRDA4078 avec les pAAV-plTALEs-ST10X et les pCR3.1-plTALEs-ST10X permet d’activer le gène endogène FXN par les deux types de vecteurs. L’observation microscopique des cellules traitées par ces effecteurs montre des étiquettes qui sont beaucoup plus lumineuses dans les cellules traitées par pAAV et pCR3.1 avec plus de signal dans les cellules traitées par pCR3.1(Fig. 74). La différence de signal est due à la différence de promoteur de chaque vecteur.

Les effecteurs plTALE-ST10X exprimés par les pAAV et pRC3.1 augmentent l’activité transcriptionnelle du gène FXN avec les mêmes efficacités par rapport aux contrôles négatifs (Fig. 75). L’activité du gène FXN augmente plus que 8 fois par le plTALEs- ST10X-6-15 exprimé soit par pRC3.1 ou par pAAV. Cette activité augmente aussi environ 5 fois par le plTALEs-ST10X-8-15 exprimé par pAAV et environ 8 fois par les plTALEs-ST10X-8-15 exprimés par pCR3.1. L’effet synergique de ces deux effecteurs exprimés soit par pCR3.1 ou pAAV augmente la transcription du gène endogène FXN plus que 18 fois dans les cellules traitées. Ces augmentations ont été normalisées par les gènes GAPDH et HPRT et par rapport aux contrôles négatifs.

Les effecteurs plTALEs-ST10X exprimés à partir les vecteurs pCR3.1 et pAAV avec promoteur CMV et CAG ont les mêmes effets d’induction de l’activité du gène endogène FXN in vitro. Les pAAV-pTALEs seront utilisés pour les tests in vivo sur des souris modèles de FRDA YG8R.

99

Figure 75: Les résultats d’induction du gène endogène FXN avec les effecteurs plTALEs- ST10X exprimés par les vecteurs pCR3.1 et pAAV.

Ces résultats ont été normalisés par rapport aux gènes GAPDH et HPRT et par rapport aux contrôles négatifs (dans les cellules FRDA4078).

6.7 L’augmentation de l’activité d’aconitase dans les cellules traitées par les