Le changement épigénomique du gène FXN avec

6.4.1 Les plTALEs-p300

Au lieu d’utiliser un domaine d’activation de la transcription tel que VP64, nous avons aussi essayé d’augmenter la transcription par un changement épigénétique du gène FXN avec l’acétyltransférase p300 tel que rapporté pour le gène IL1RN, MYOD et OCT4 [65]. Pour cela, 3 plTALEs-p300 qui ciblent les séquences 6-15, 8-15 et F4-15 (Fig. 60) (Tableau 6) ont été construits dans le plasmide pCR3.1 qui contient le promoteur CMV. Les plTALEs-p300 ont été faits par le clonage In-fusion entre les vecteurs pCR3.1- plTALEs et l’insert p300. Un fragment de p300 de taille 2010 pb a été amplifié par PCR avec 2 amorces, p300_info_F et p300_info_F. Parallèlement, une digestion enzymatique a été faite sur pCR3.1-plTALEs-VP46-6-15, pCR3.1-plTALEs-VP46-8-15 et pCR3.1- plTALEs-VP46-F4-15 pour éliminer le fragment de VP64 et le remplacer par le p300. Le vecteur linéaire obtenu est de 7800 pb contient le N-ter, les RVD et le C-ter (Fig. 61). Les clones positifs ont été sélectionnés après séquençage avec deux amorces, p300_info_F et p300_info_R qui permettent de séquencer du côté 5’ et 3’ de p300, afin de vérifier les séquences correctes de ces constructions.

Le séquençage permet d’identifier les bonnes constructions plTALEs-p300-6-15, plTALEs-p300-8-15 et plTALEs-p300-F4-15 qui contiennent p300 pour les tester in vitro sur les cellules des FRDA4078. Le même protocole de nucléofection a été utilisé pour

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traiter ces cellules avec ces effecteurs suivi par des analyses de qRT-PCR et western pour vérifier l’activité de ces plTALEs-p300.

Figure 60: La structure moléculaire de plTALE-P300 dans le pCR3.1 contient le promoteur CMV, le N-ter, le RVD, le C-ter, le NLS-VP64 et le p300.

Tableau 6: La liste des plTALE-p300 avec leurs séquences RVD et leurs séquences cibles.

Figure 61: La présentation des fragments du vecteur linéaire et de l’insert utilisés dans le clonage In-fusion pour construire les plTALEs-p300.

A) Le produit de la digestion pRC3.1-plTALEs-VP64 par AccIII et ApaI. B) Le produit d’amplification de p300 avec 2 amorces, p300_info_F et p300_info_F.

6.4.2 L’induction du gène FXN par plTALE-p300

Les cellules FRDA4087 ont été traitées par ces 3 plTALEs-p300. Par la suite, des analyses ont été faites sur l’activité de la transcription et de l’expression du gène FXN dans ces cellules traitées par rapport aux contrôles négatifs (les cellules non traitées et les cellules traitées par pCR3.1 vide) (Fig. 62). Les résultats montrent que ces plTALEs-p300 n’activent pas fortement la transcription du gène FXN dans les cellules traitées par rapport aux contrôles négatifs. Le nombre de copies d’ARN augmente un peu suite au traitement avec le plTALEs-p300-8-15 (une augmentation significative) et le plTALE-p300-6-15 (une augmentation non significative) par rapport aux contrôles négatifs avec une absence d’effet de plTALE-p300-F4-15. Le taux de l’activité transcriptionnelle a été normalisé par rapport aux gènes GAPDH et HPRT et montre des augmentations significatives

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d’environ 1,5 fois par plTALE-p300-8-15, 1,2 fois par plTALEs-p300-6-15 et moins d’une fois par plTALE-p300-F4-15 par rapport aux contrôles négatifs.

Les effets des plTALEs-p300 sont très faibles par rapport aux effets des plTALEs-VP64 qui ciblent les mêmes séquences. Donc, pour activer le gène endogène FXN, les effecteurs VP64 sont beaucoup plus puissants que les effecteurs p300 fusionnés avec des plTALEs qui ciblent les séquences au niveau du promoteur et de l’intron 1 du gène FXN.

Figure 62: La transcription du gène FXN dans les cellules traitées par les plTALEs-p300 et les cellules témoins.

A) Le nombre de copies d’ARNm FXN dans les cellules traitées et les cellules témoins (* p value = 0,0202). B) et C) Le taux d’augmentation de la transcription du gène FXN normalisé par deux gènes GAPDH (** p value = 0,0085, **** p value ˂ 0,0001) et HPRT (** p value = 0,0285, **** p value ˂ 0,0001).

Nous avons testé les effets synergiques des différentes combinaisons des plTALEs-VP64 avec plTALEs- p300 et de plusieurs plTALE-p300 ensemble ciblant les différentes séquences du gène FXN (Fig. 63). Des analyses ont été faites sur les effets synergiques de ces effecteurs sur la transcription du gène FXN des cellules FRDA4078 normalisé par rapport aux gènes GAPDH et HPRT et par rapport aux contrôles négatifs. Les résultats montrent que l’activité transcriptionnelle du gène FXN dans les cellules FRDA4078 augmente par l’effet de combinaison plTALE-VP64-6-15 et plTALE-p300-8-15 environ de 2 fois. Les résultats précédents montrent que plTALE-VP64-6-15 augmente aussi l’activité transcriptionnelle du gène FXN dans les cellules FRDA4078 environ 2 fois. Le même effet a été observé lorsque ces cellules ont été traitées par 2 autres effecteurs ensemble plTALE-VP64-8-15 et plTALE-p300-6-15. Donc l’effet de la combinaison de ces 2 plTALEs (VP64 + p300) n'active pas plus la transcription du gène FXN, que l’effet d’un seul effecteur VP64. Ainsi les combinaisons plTALE-VP64 et plTALE-p300 qui ciblent les séquences 6 et 8 n’ont pas d’effet synergique sur l’induction du gène FXN dans les cellules FRDA4078. Par contre, l’utilisation d’une combinaison des 2 plTALEs-

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p300 qui ciblent les séquences 6-15 et 8-15 dans ces cellules, augmente significativement l’activité transcriptionnelle du gène FXN environ 2 fois par rapport aux contrôles. Donc la combinaison des 2 plTALEs-p300 a un effet synergique sur l’augmentation de l’activité transcriptionnelle du gène FXN des cellules FRDA4078 par rapport aux contrôles négatifs et par rapport à l’effet d’un seul plTALE-p300. Cette activité est l’équivalente à l’effet d’un seul plTALE-VP64 avec 15 RVD qui ciblent séquences 6-15, 8-15 ou F4-15.

Figure 63: L’activité transcriptionnelle du gène FXN avec l’effet synergique des effecteurs VP64 + p300 et plusieurs p300 ensemble qui ciblent séquences 6, 8 et F4.

Les effecteurs utilisés pour ce test VP64-6 (plTALE-VP64-6-15), VP64-8 (plTALE-VP64-8-15), p300-6 (plTALE-p300-6-15), p300-8 (plTALE-p300-8-15). Les résultats statistiques de ce test sont (* p value = 0,0349) pour le GAPDH et (* p value = 0,0114 et ** p value ˂ 0,0063) pour HPRT.

Nous avons analysé l’effet des plTALEs-p300 qui ciblent des séquences 6-15, 8-15 et F4- 15 sur l’expression de la protéine frataxine dans les cellules FRDA4078 traitées par ces effecteurs (Fig. 64). Les protéines extraites après l’extraction d’ARNm ont été analysées par western blot. Le taux d’expression de la protéine a été normalisé par rapport au gène GAPDH et par rapport aux contrôles négatifs. Les résultats montrent que les effecteurs p300 fusionnés avec plTALEs et qui ciblent les séquences 6-15, 8-15 et F4-15 réduisent l’expression de la protéine frataxine de 30% pour les plTALE-p300-6-15 et plTALE- p300-8-15 et de 60% pour plTALE-p300-F4-15. L’utilisation de p300 et de VP64 ensemble diminue aussi l’expression de la frataxine. Par contre, l’utilisation 2 plTALE- p300 qui ciblent les séquences 6-15 et 8-15 augmentent l’expression de la frataxine environ 2 fois. Donc, l’effet des effecteurs p300 sur l’induction du gène FXN entraine un changement épigénétique de ce gène. Ce changement apparait avec l’utilisation de plusieurs plTALEs-p300 qui ciblent différentes séquences au niveau du site d’initiation de la transcription du gène FXN.

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Figure 64: L’analyse de l’expression de la protéine frataxine dans les cellules traitées avec plTALE-p300 et avec plusieurs effecteurs VP64 et p300 et dans les cellules témoins.

6.5 L’induction du gène FXN avec plTALEs-SunTag qui recrute 10 ou 24 copies de