- c(RGDfK) - SRP-c(RGDfK) - SRP-Cy5.5-c(RGDfK)
- Observation des chromatogrammes détectant un signal d’émission de fluorescence à 281
nm (Ȝexc = 240 nm) :
En ce qui concerne l’étude des chromatogrammes détectant un signal d’émission de fluorescence à 281 nm, une étude préliminaire s’est avérée nécessaire : le chromatogramme du peptide seul en solution aqueuse a été réalisé. Un unique pic dont le temps de rétention est centré sur 7,75 min a été détecté (Figure III.13). Les chromatogrammes des deux échantillons de SRPs fonctionnalisées par du c(RGDfK) (SRP-c(RGDfK) et SRP-Cy5.5-c(RGDfK)) présentent un petit pic à ce même temps de rétention, attribué aux fragments de dégradation des SRPs, à savoir Si(OH)3 -DOTA-c(RGDfK) et/ou [GdIII(Si(OH)3-DOTA-c(RGDfK))] (Figure III.13). Cependant, la majeure proportion d’émission de fluorescence observée a été détectée pour des temps de rétention compris entre 13 et 23 min, rendant la quantité de fragments de dégradation négligeable.
Figure III.13. Chromatogrammes du c(RGDfK) seul et des échantillons de SRPs fonctionnalisés avec du c(RGDfK), obtenus par détection du signal d’émission de fluorescence à 281 nm (Ȝexc = 240 nm).
En considérant la linéarité de la relation entre l’aire sous le pic et la concentration du peptide (pas d’émission de fluorescence détectée en l’absence de peptide), l’aire sous le pic des SRP-c(RGDfK) et sous celui des SRP-Cy5.5-SRP-c(RGDfK) devrait être proportionnelle à la concentration en c(RGDfK) (Kafka et al., 2010). Pour faciliter la quantification du peptide, une seule gaussienne a été tracée ; l’aire de cette gaussienne et son temps de rétention sont rapportés dans le Tableau III.2.
Tableau III.2. Exploitation des chromatogrammes obtenus par détection d’émission de fluorescence à 281 nm (Ȝexc = 240 nm) pour l’estimation du nombre de c(RGDfK) par ion GdIII.
c(RGDfK) SRP-c(RGDfK) SRP-Cy5.5-c(RGDfK)
HPLC (Ȝexc=240nm, Ȝem=281nm) ([c(RGDfK)] = 0.246mM)
Temps de Rétention (min) 7.93 16.85 16.61 Aire sous la Gaussienne 29423 30190 32604 Rapport c(RGDfK) / GdIII / 0.40 0.44
Chapitre III – Fonctionnalisation des SRPs avec un peptide cyclique
contenant le motif RGD pour le ciblage de l’intégrine Į
ȣȕ
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SRPs SRP-c(RGDfK) SRP-Cy5.5 SRP-Cy5.5-c(RGDfK)
Analyses Elémentaires - (Pourcentages massiques)
Exp. Theo. Err. Exp. Theo. Err. Exp. Theo. Err. Exp. Theo. Err.
%Gd 8.23 8.24 0.01 6.98 7.35 0.37 7.88 8.10 0.22 7.11 7.22 0.11
%Si 10.08 10.13 0.05 8.03 8.48 0.45 10.64 10.97 0.33 9.26 9.43 0.17
%N 8.63 8.91 0.28 10.42 10.72 0.30 8.60 9.10 0.50 10.40 9.88 0.52
%C 31.94 31.72 0.22 35.85 35.42 0.43 35.54 35.17 0.37 32.86 33.38 0.52
Les quantités de peptide par ion GdIII obtenues par HPLC (0,40 pour les SRP-c(RGDfK) et 0,44 pour les SRP-Cy5.5-c(RGDfK)) sont du même ordre de grandeur que celles obtenues par fluorescence.
III.3.2.3. Analyse élémentaire
Les analyses élémentaires ont également permis d’évaluer le taux de greffage du c(RGDfK) aux SRPs. Les pourcentages massiques obtenus par analyse élémentaire sont regroupés dans le Tableau III.3 et les rapports molaires déduits de ces pourcentages massiques sont rapportés dans le Tableau III.4.
Deux hypothèses ont été faites pour estimer la composition chimique de chacun des échantillons contenant les SRPs :
chaque SRP possède 10 molécules de DOTA ;
le rapport molaire APTES/TEOS de la matrice de polysiloxane reste constant pendant les différentes étapes de synthèse et de purification (0,6 APTES / 0,4 TEOS).
Enfin, en accord avec les résultats de dosage des molécules de DOTA vacantes par phosphorescence (cf. article), une dernière hypothèse sur le nombre d’atomes de gadolinium par SRP est prise en compte : les SRPs initiales contenaient 3 (±0.5) atomes de gadolinium par SRP tandis que les SRPs finales (après marquage à la Cy5.5 et/ou greffage du c(RGDfK), et « remontée en ions GdIII ») en contiennent 5 (±0.8).
En considérant ces hypothèses et les rapports molaires – à savoir Si/Gd, C/Gd and N/Gd – il est possible de déduire une formule brute approximative par une méthode empirique. Comme seuls les pourcentages massiques des atomes de Gd, Si, C et N ont été mesurés, il convenait de prendre en compte dans nos calculs les atomes différents de ceux-ci, susceptibles d’être contenus dans les échantillons. Par exemple, les molécules d’eau ont dû être prises en compte, tout comme les molécules de solvant. D’ailleurs, les SRPs initiales ayant été synthétisées dans du diéthylène glycol (DEG), quelques molécules de solvant ont pu être piégées au sein de la matrice de polysiloxane durant la synthèse.
Les formules brutes indiquées dans le Tableau III.5 sont approximatives. Le nombre de molécules d’eau a été estimé à titre indicatif et ces molécules d’eau pourraient d’ailleurs être remplacées par des contre-ions par exemple. Ces formules brutes ont été déduites avec une erreur absolue inférieure à 0,55% par rapport aux pourcentages massiques fournis dans le Tableau III.3.
Tableau III.3. Analyses élémentaires (en pourcentages massiques). Pour chaque échantillon, les données expérimentales sont présentées en premier (en noir) ; elles sont fournies par le Service Central d’Analyses de Solaize, du CNRS. Ensuite, les
Chapitre III – Fonctionnalisation des SRPs avec un peptide cyclique
contenant le motif RGD pour le ciblage de l’intégrine Į
ȣȕ
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SRPs SRP-c(RGDfK) SRP-Cy5.5 SRP-Cy5.5-c(RGDfK)
Analyses Elémentaires - Rapports molaires
Si/Gd 6.9 6.5 7.6 7.3
N/Gd 11.8 16.8 12.3 16.4
C/Gd 50.9 67.3 59.1 60.6
SRPs SRP-c(RGDfK) SRP-Cy5.5 SRP-Cy5.5-c(RGDfK)
Analyses Elémentaires - Formules brutes
Nombre d'atomes/molécules de ……. par SRP
Gd 5 5 5 5.5 DOTA 10 10 10 10 APTES/TEOS 20.6 / 13.8 19.4 / 12.9 22.7 / 15.2 24.1 / 16.1 Cy5.5 / / 0.15 0.27 c(RGDfK) / 2.5 / 2.2 H2O (ou contre-ions) 60 54 15 83 DEG 0 0 5 0 SRP-c(RGDfK) SRP-Cy5.5-c(RGDfK) Analyse élémentaire
Nombre d'ions GdIII par SRP 5 5,5
Nombre de c(RGDfK) par SRP 2,5 2,2 Spectroscopie de Fluorescence Nombre de c(RGDfK) par SRP 2,1 1,9 HPLC Nombre de c(RGDfK) par SRP 2 2,4 Moyenne 2,2 ± 0,3 2,2 ± 0,3
pourcentages massiques théoriques sont indiqués (en bleu) : ils correspondent aux pourcentages massiques déduits des formules brutes estimées présentées dans le Tableau III.5. Enfin, les écarts absolus entre les données expérimentales et
théoriques sont indiqués.
Tableau III.4. Rapports molaires déduits des pourcentages massiques fournis par le Service Central d’Analyses de Solaize.
Tableau III.5. Formules brutes estimées pour chacun des échantillons et déduites des pourcentages massiques fournis par le Service Central d’Analyses de Solaize.
Par analyse élémentaire, le nombre de c(RGDfK) par SRP est estimé à 2,5 pour les SRP-c(RGDfK) et à 2,2 pour les SRP-Cy5.5-SRP-c(RGDfK).
III.3.2.4. Récapitulatif des 3 techniques ayant permis l’estimation de la quantité
de c(RGDfK) par SRP
En multipliant les rapports molaires c(RGDfK)/GdIII obtenus par spectrométrie de fluorescence et par HPLC par le nombre d’ions GdIII estimés par analyse élémentaire, nous obtenons un nombre de peptide par SRP. Les résultats sont regroupés dans le Tableau III.6.