traditionnelle. Adaptée de University of Wisconsin-Madison.
Plusieurs études précliniques ont démontré l’efficacité de ces fluorophores vectorisés (Hutteman et al., 2011). Par exemple, Terwisscha van Scheltinga et al. se sont intéressés à des anticorps ciblant le VEGF ou l’HER2 marqués par des fluorophores émettant dans le proche-IR et ont prouvé leur spécificité pour la tumeur ainsi que la détection sensible des lésions tumorales in vivo (Figure II.17) (Terwisscha van Scheltinga et al., 2011).
Figure II.17. Images per-opératoires representatives d’un fluorophore vectorisé (bevacizumab-800CW) injecté dans une souris porteuse d’une tumeur ovarienne de lignée A2780, en sous-cutané. Le faible bruit de fluorescence observé dans l’estomac
provient de la chlorophylle contenue dans la nourriture de l’animal. Adaptée de Terwisscha van Scheltinga et al., 2011.
Ces études s’avèrent prometteuses pour de futures études cliniques avec ce genre d’anticorps spécifiques marqués par des fluorophores pour des applications en chirurgie guidée par imagerie de fluorescence (Terwisscha van Scheltinga et al., 2011).
Les chirurgiens se fiant essentiellement à la palpation des tumeurs et à leur inspection visuelle, il existe un besoin urgent de développer de nouvelles modalités d’imagerie per-opératoire capables de délimiter avec exactitude et en temps réel les contours d’une tumeur et des ganglions lymphatiques atteints. Ainsi, les risques de dommages au niveau des structures vitales et de cas de récurrence du cancer sont moindres. L’identification de structures devant être réséquées, comme les tissus tumoraux et les ganglions lymphatiques, ou bien épargnées, telles que les nerfs, les uretères et les canaux biliaires, revêt alors une importance capitale dans le domaine de la chirurgie oncologique (Schaafsmaa et al., 2011).
L’expérience clinique du VIC en imagerie par fluorescence dans le proche-IR en per-opératoire est assez étendue et montre un profil d’innocuité très favorable. Cependant, l’utilisation du VIC pour la détection et la démarcation de tumeurs reste limitée principalement parce qu’il ne présente pas de fonction chimique permettant de le coupler à des vecteurs spécifiques de tumeur, ce qui en fait un fluorophore non spécifique. Le VIC n’est donc pas une sonde fluorescente idéale et de nombreux fluorophores disposant de groupements fonctionnalisables et présentant des propriétés optiques supérieures sont en cours de développement. Le passage de ces sondes fluorescentes idéales à des essais cliniques représente un défi de taille et est susceptible d’améliorer considérablement la chirurgie guidée par imagerie de fluorescence dans le proche-IR.
Chapitre II – Etudes de pré-vectorisation des SRPs
118
II.3.1.4. Présentation des Cyanines et choix de la Cy5.5
La Cyanine (Cy) est l’un des fluorophores organiques les plus répandus pour le marquage des biomolécules (Hermanson, 2008). Elle est constituée de deux structures cationiques hétérocycliques azotées reliées par un pont polyméthinique. L’une des deux structures cycliques comporte nécessairement un atome d’azote quaternarisé (charge positive). Les structures cycliques sont généralement des cycles indoles (dans le cas des Cy3, 5 ou 7) ou benzo-indoles (dans le cas des Cy3.5 ou 5.5) (Figure II.18) car ces structures aromatiques possèdent des coefficients d’extinction molaire extrêmement élevés et fournissent alors des marqueurs fluorescents vifs et intenses.
Figure II.18. Représentation de différentes molécules de Cyanine sous leur forme activée (ester NHS). Adaptée de GE Healthcare®.
Le pont polyméthinique quant à lui est responsable du caractère fluorescent de la Cyanine et détermine sa nomenclature. La structure générale de la famille des Cyanines peut être représentée par la formule suivante : X-(CH=CH)n-CH=Y où X et Y sont les hétérocycles azotés aux deux extrémités du pont polyméthinique et n peut varier de 1 à 3 (n=1 : Cy3, n=2 : Cy5, n=3 : Cy7). Plus le pont polyméthinique est long, plus les longueurs d’onde d’absorption et d’émission se rapprochent de l’infrarouge. Les Cyanines sont souvent présentées avec quatre groupements négatifs (sulfonates) de manière à augmenter leur solubilité dans l’eau et à créer des répulsions de charges entre les différents marqueurs pour éviter les interactions fluorophore-fluorophore et ainsi empêcher le quenching de luminescence (Hermanson, 2008).
La Cy5 est utilisée depuis plus de 5 ans dans l’équipe FENNEC de l’ILM pour ses propriétés spectrales dans le domaine du proche-IR (Cy5 : ȜAbsorbance max.= 649 nm, İ = 250 000 M-1.cm-1, ȜEmission max.= 670 nm, ĭ > 0,28) (Faure et al., 2009 ; Bridot et al., 2007). La Cy5.5 s’avère légèrement plus avantageuse que la Cy5 du fait du décalage de 15-20 nm de ses longueurs d’ondes d’absorbance et d’émission maximales vers le proche-IR par rapport à celles de la Cy5 (Cy5.5 : ȜAbsorbance max.= 675 nm, İ = 250 000 M-1.cm-1, ȜEmission max.= 694 nm, ĭ > 0,28), permettant de s’affranchir un peu plus des problèmes liés à l’absorption de la mélanine et des hémoglobines oxygénée et désoxygénée. Ainsi, le marquage fluorescent des SRPs est désormais réalisé avec de la Cy5.5 (Lux et al., 2011).
Cy3-NHS: n = 1 Cy5-NHS : n=2 Cy7-NHS : n=3
Cy3.5-NHS : n=1 Cy5.5-NHS : n=2
Chapitre II – Etudes de pré-vectorisation des SRPs
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SRPs dans H2O [Gd3+] = 100 mM Cy5.5 dans DMSO
anhydre [Cy5.5] = 1,8 mM SRPs + Cy5.5-NHS 8h pH 7,4 Gd3+ supplémentaires SRP-Cy5.5 SRP-Cy5.5 + Gd3+ 12h pH 5-6 SRP-Cy5.5 « remontées en Gd » 5 kDa x 1000 NP-Cy5.5 « remontées en Gd » purifiées et lyophilisées COUPLAGE PEPTIDIQUE PURIFICATION STOCKAGE AJOUT Gd3+
Numero aliquot Cy5.5 / Gd Gd suppl. / Gd
Rapports molaires initiaux
1 1/10000 = 0,0001 0,5 2 1/1000 = 0,001 0,5 3 1/500 = 0,002 0,5 4 1/200 = 0,005 0,5 5 1/100 = 0,010 0,5 6 1/40 = 0,025 0,5 50 < [Gd3+] < 100 mM 50 < [Gd3+] < 100 mM [Gd3+] > 10 mM
II.3.2. Greffage de la Cy5.5 aux nanoparticules et caractérisations
Le greffage de la Cy5.5-NHS aux SRPs permet de démontrer la possibilité de couplage peptidique d’une molécule possédant une fonction acide carboxylique terminale (présentée sous sa forme active) avec les fonctions amines primaires du réseau de polysiloxane des SRPs. Pour estimer le nombre d’amines primaires accessibles en surface des SRPs, une gamme de SRPs fluorescentes est réalisée.
II.3.2.1. Réalisation d’une gamme de nanoparticules fluorescentes – Partie
expérimentale
La Figure II.19 représente les différentes étapes du greffage de la Cy5.5 sur les nanoparticules. Chaque étape est réalisée à température ambiante et les concentrations des nanoparticules sont indiquées en mol/L d’élément gadolinium.
Figure II.19. Schéma représentant les différentes étapes de greffage de la Cy5.5 sur les nanoparticules et Tableau indiquant les rapports molaires de Cy5.5 et d’ions GdIII supplémentaires introduits par rapport à la quantité de GdIII initiale.
Les SRPs sont redispersées dans l’eau ([Gd3+] = 100 mM) tandis que la Cy5.5-NHS est dissoute dans du DMSO anhydre ([Cy5.5] = 1,8 mM). Les SRPs sont réparties en six aliquots et la quantité de Cy5.5-NHS désirée est ajoutée à chacun des aliquots selon le tableau de la Figure II.19. Pour que les SRPs soient soumises aux mêmes conditions, le volume de DMSO est égalisé dans chacun des aliquots. Le pH est ajusté à 7,4 dans chacun des aliquots et les solutions sont agitées pendant 8h. Des ions GdIII supplémentaires sont ajoutés à chacun des aliquots via une solution aqueuse préparée à partir de GdCl3.6H2O (rapport molaire Gd supplémentaire / Gd initial = 0.5 / 1). Le
Chapitre II – Etudes de pré-vectorisation des SRPs
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500 600 700 800 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Ab sorb an ce ( u .a.) Longueur d'onde (nm) 1 2 3 4 5 6 A)B) Numero aliquot Rendement de greffage Cy5.5 / Gd final Quantification par Absorption UV-visible
1 100% 0,0002 2 100% 0,002 3 94% 0,003 4 92% 0,009 5 82% 0,015 6 61% 0,026
pH de chacun des aliquots est ajusté à 5-6 et les solutions finales sont agitées pendant 12h. Enfin, les SRPs sont purifiées par filtration tangentielle jusqu’à un facteur 1000 minimum, sur une membrane de 5 kDa, de manière à éliminer le fluorophore non conjugué, le NHS hydrolysé (issu de la Cy5.5) et les ions GdIII non chélatés. Le pH des solutions aqueuses de SRPs fluorescentes purifiées est ajustés à 7,4 puis ces solutions aqueuses sont lyophilisées. Les SRPs 1 à 6 (selon la quantité de Cy5.5 contenue) peuvent ainsi être stockées de manière stable pendant plusieurs mois, sans altération, à température ambiante et à l’abri de la lumière.
II.3.2.2. Rendements de greffage des nanoparticules fluorescentes
Les spectres d’absorption UV-visible des différentes SRPs fluorescentes 1 à 6 sont enregistrés et comparés avant et après purification. Les maxima d’absorption des SRPs 1 à 6 (679 nm) (Figure II.20. (A)) sont légèrement décalés par rapport au maximum d’absorption de la Cy5.5 seule (675 nm).
Figure II.20. (A) Spectres d’absorption UV-visible des SRPs fluorescentes 1 à 6 après purification. (B) Rendements de greffage de la Cy5.5 et rapports molaires Cy5.5/Gd finaux calculés à partir des spectres d’absorption UV-visible avant et après
purification des SRPs.
Les calculs de rendements de greffage de la Cy5.5 sont réalisés à partir des maxima d’absorption avant et après purification (Figure II.20. (B)). Plus la quantité de Cy5.5 introduite est élevée, plus les rendements de greffage diminuent, ce qui s’explique par la diminution de l’accessibilité des sites de greffage et l’encombrement stérique au fur et à mesure du greffage de la Cy5.5 sur les nanoparticules. Lors de la purification, la Cy5.5 non greffée ainsi que les nanoparticules dont la masse moléculaire était inférieure à celle de la membrane, à savoir 5 kDa, sont éliminées : c’est la raison pour laquelle les rapports molaires Cy5.5/Gd finaux sont plus élevés que les initiaux (Figure II.20. (B)).
Cette étude démontre l’accessibilité des amines primaires en surface des SRPs. Cette gamme de SRPs fluorescentes est ensuite testée in vivo, de manière à observer leur biodistribution et à