395 nm) sont recueillis entre 550 et 650 nm (Figure II.12). Deux pics d’émission sont observés à 593 et 615 nm, correspondant respectivement aux transitions de spin interdites f-f 5D0Æ7F1 et 5D0Æ7F2 de l’ion EuIII chélaté (Matsumoto, 2010). L’intensité de phosphorescence de la seconde bande de transition (5D0Æ7F2) dépend fortement de la symétrie du ligand chélatant l’ion EuIII ; par conséquent, seule la première bande de transition (5D0Æ7F1) est prise en considération pour le dosage du nombre de ligands DOTA vacants (Jokanoviþ et al., 2006). En présence de ligands DOTA vacants, l’europium est chélaté et le maximum d’intensité de phosphorescence augmente au fur et à mesure que l’ion EuIII est ajouté (Figure II.12. Etapes (1) à (3)). Quand les DOTA sont saturés, c'est-à-dire que chacun d’entre eux chélate soit un ion GdIII, soit un ion EuIII, le maximum d’intensité de phosphorescence devient quasiment constant (Figure II.12. Etapes (3) et (4)).
La courbe représentant le maximum d’intensité de phosphorescence à 593 nm (transition
5D0Æ7F1) en fonction du rapport molaire Eu/Gd est ensuite tracée. La première partie de la courbe est une droite linéaire : l’intensité de phosphorescence augmente avec la concentration en complexes [EuIII(DOTA)]. La deuxième partie de la courbe est un plateau et représente la saturation des DOTA : quelque soit la quantité d’EuIII ajoutée, l’intensité de phosphorescence du complexe [EuIII(DOTA)] est constante. En effet, la phosphorescence des ions EuIII libres (EuIII-aqua) est négligeable devant celle des ions EuIII chélatés du fait du quenching de luminescence de l’ion EuIII par les désexcitations non radiatives vibrationnelles liées aux oscillateurs O-H des molécules d’eau. L’intersection des deux droites indique le nombre d’ions EuIII nécessaires à ajouter par ion GdIII pour saturer les ligands DOTA vacants (cf. § II.2.2.).
II.2.2. Partie expérimentale
Les SRPs sont redispersées dans l’eau et divisées en quinze aliquots. Différentes quantités de chlorure d’europium hexahydraté (EuCl3.6H2O) sont ajoutées à chacun des aliquots (rapports molaires Eu/Gd compris entre 0 et 10). Les solutions sont agitées pendant 48 h à pH 5-6, de manière à assurer la complexation totale des ions EuIII par les ligands DOTA vacants, sans former d’hydroxydes de gadolinium ou d’europium (Hemmer et al., 2012 ; Moore et al., 2009 ; Zhang et al., 2009) (cf. § II.1.4.4.).
Les quinze spectres d’émission de phosphorescence des complexes [EuIII(DOTA)] des SRPs (Ȝexcitation = 395 nm) sont recueillis entre 550 et 650 nm (Figure II.13). Les deux pics d’émission à 593 et 615 nm, correspondant respectivement aux transitions de spin interdites f-f 5D0Æ7F1 et 5D0Æ7F2 de l’ion EuIII chélaté, sont observés (Matsumoto, 2010).
Chapitre II – Etudes de pré-vectorisation des SRPs
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560 580 600 620 640 0 10 20 30 40 50 In te nsi té de Ph osph or esce nce ( u. a .) Longueur d'onde (nm) Eu/Gd = 0 Eu/Gd = 0,15 Eu/Gd = 0,30 Eu/Gd = 0,50 Eu/Gd = 0,75 Eu/Gd = 1 Eu/Gd = 2 Eu/Gd = 3 Eu/Gd = 4 Eu/Gd = 5 Eu/Gd = 6 Eu/Gd = 7 Eu/Gd = 8 Eu/Gd = 9 Eu/Gd = 10Figure II.13. Spectres d’émission de phosphorescence des complexes [EuIII(DOTA)] des SRPs en fonction de leur rapport molaire Eu/Gd (Ȝexcitation = 395 nm – concentration SRP : [Gd3+] = 30 ȝM)
La courbe représentant les maxima d’intensité de phosphorescence à 593 nm (transition
5D0Æ7F1) en fonction du rapport molaire Eu/Gd est alors tracée (Figure II.14).
Figure II.14. Courbe représentant les maxima d’intensité de phosphorescence des complexes [EuIII(DOTA)] des SRPs à 593 nm en fonction de leur rapport molaire Eu/Gd.
Comme annoncé dans le principe du dosage, la première partie de la courbe est une droite linéaire : l’intensité de phosphorescence augmente avec la concentration en complexes [EuIII(DOTA)]. La deuxième partie de la courbe est un plateau et représente la saturation des ligands DOTA : quelle que soit la quantité d’EuIII ajoutée, l’intensité de phosphorescence du complexe [EuIII(DOTA)] est
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 10 20 30 40 50 Max ima d' In tens ité d e P hosp hor esce nce (u. a .) nEu / nGd
Chapitre II – Etudes de pré-vectorisation des SRPs
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constante. L’intersection des deux droites indique le nombre d’ions EuIII nécessaires à ajouter par ion GdIII pour saturer les ligands DOTA vacants.Conformément à la méthode décrite précédemment, l’intersection des deux droites indique que 2,2 ions EuIII par ion GdIII doivent être ajoutés pour arriver à saturation des ligands DOTA vacants. Ainsi, les SRPs étudiées disposent de 69% de sites coordinants libres. Par conséquent, si le nombre total de ligand est évalué à 10 environ, 3 ± 0.5 ligands DOTA chélatent un ion GdIII tandis que les 7 ± 0.5 ligands DOTA restants sont vacants.
Ces ligands DOTA vacants permettent la vectorisation des SRPs par des molécules présentant une fonction amine primaire terminale, ou encore la complexation d’autres ions métalliques d’intérêt, comme par exemple l’111In pour la TEMP. Après chaque greffage de molécule ciblante, du chlorure de gadolinium hexahydraté (GdCl3.6H2O) est généralement ajouté aux solutions de nanoparticules pour atteindre des relaxivités longitudinales plus élevées (cf. § II.1.4.4.).
II.3. Etude de l’accessibilité des fonctions amines primaires du
réseau de polysiloxane
Le réseau de polysiloxane des SRPs est composé de TEOS et d’APTES, dont le rapport molaire considéré constant au cours des différentes étapes de synthèse et de purification, est de 40% TEOS / 60% APTES (cf. Chapitre I, § I.5.1.2.). Les fonctions amines primaires du réseau de polysiloxane proviennent des molécules d’APTES. Elles ne sont cependant pas toutes accessibles pour les raisons suivantes :
- des molécules d’APTES ont pu être « piégées » au sein du réseau de polysiloxane ; leurs fonctions amines primaires demeurent inaccessibles ;
- certaines fonctions amines primaires ont été utilisées pour le greffage du DOTA-GA ; le couplage peptidique a donné lieu à une fonction amide et les fonctions amines primaires initiales ne sont plus disponibles ;
- la matrice de polysiloxane constitue l'élément central de la nanoparticule : elle est entourée d’une dizaine de ligands DOTA ; le greffage de grosses molécules risque d’être soumis à des problèmes d’encombrement stérique.
L’objectif de cette partie est de démontrer que le greffage de molécules présentant une fonction acide carboxylique terminale sur les SRPs reste possible et d’estimer le pourcentage d’amines accessibles pour mener à bien ce greffage.
II.3.1. Choix du fluorophore pour fonctionnaliser les SRPs via les
fonctions amines primaires du réseau de polysiloxane
Pour cette étude, nous avons choisi de greffer aux SRPs un fluorophore organique possédant une fonction acide carboxylique terminale présentée sous sa forme activée (ester NHS) (Figure II.18). Le marquage fluorescent des SRPs présente plusieurs avantages : il fournit aux nanoparticules une