DOTA
2. Via les –NH2du réseau de polysiloxane
Molécules à greffer possédant une fonction terminale de type…
–COOH –NH2
Création d’une liaison amide
6L 2
2 2
1+
Figure II.1. Représentation des deux approches possibles pour la vectorisation d’une SRP avec des molécules possédant les fonctions terminales sélectionnées, à savoir : amine primaire ou acide carboxylique.
Dans les deux cas, la réaction entre une amine primaire et un acide carboxylique aboutit à la formation d’une liaison amide et à l’élimination d’une molécule d’eau. Cette réaction de couplage peptidique est réalisée par activation de l’acide carboxylique, que nous développerons dans la première partie de ce chapitre. Les deuxième et troisième parties de ce chapitre seront quant à elles consacrées à l’estimation du nombre de sites de greffage accessibles à la surface des SRPs.
II.1. Réaction de couplage peptidique
Récemment, le champ de la bioconjugaison s’est élargi de façon considérable : il existe aujourd’hui de nombreuses possibilités pour conjuguer des entités apportant une fonctionnalité aux nanoparticules (Yu et al., 2012 ; Hermanson, 2008). Weissleder et al. ont, par exemple, dressé une bibliothèque recensant les différentes méthodes de modification de surface de nanoparticules magnéto-fluorescentes présentant des fonctions amines primaires par de petites molécules possédant des fonctions réactives terminales de type anhydride, amine, hydroxy, carboxy, thiol et époxyde sur (Sun et al., 2006). Nous nous sommes inspirés de l’une d’entre elles, à savoir le couplage d’une fonction acide carboxylique et d’une fonction amine, pour greffer les molécules désirées sur les SRPs.
Chapitre II – Etudes de pré-vectorisation des SRPs
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II.1.1. Généralités
Un acide carboxylique, en présence d’une amine, forme rapidement un carboxylate d’ammonium selon la réaction acido-basique suivante (1) :
(1) L’amine primaire, lorsqu’elle se protonne, perd son caractère nucléophile (perte du doublet non-liant : l’addition nucléophile sur l’acide carboxylique n’est plus possible). Le carboxylate d’ammonium formé met un terme à la réaction de condensation.
Certains sels d’ammonium, chauffés à haute température, peuvent néanmoins se déshydrater et donner lieu à la formation d’amides, comme c’est le cas pour l’éthanamide (2).
(2) Cette méthode est rarement suivie car elle nécessite de hautes températures de chauffage et par conséquent, des solvants organiques à haut point d’ébullition. De plus, elle n’est pas compatible avec tous les sels d’ammonium. Des méthodes plus adéquates pour la préparation d’amides ont été développées et décrites par Hermanson (Hermanson, 2008).
II.1.2. Agents de couplage
Les plus petits agents de couplage crées pour la bioconjugaison sont appelés « agents de réticulation de taille nulle » (zero-length crosslinkers) (Hermanson, 2008). Ces composés interviennent dans les réactions de couplage peptidique pour la formation de liaisons sans ajout d’atome ou de bras espaceur.
Les carbodiimides font partie de cette famille d’agents de couplage et permettent la création de liaisons amides par condensation d’amines primaires avec des acides carboxyliques. L’EDC (chlorhydrate de N-(3-diméthylaminopropyl)-N’-éthylcarbodiimiide) est le carbodiimide le plus répandu. Utilisé dans les procédés de conjugaison avec le NHS (N-hydroxysuccinimide), il est pratiquement universel ; le couple EDC/NHS représente le couple d’agents d’activation le plus couramment employé dans le monde pour la bioconjugaison (eq 3) (Hermanson, 2008).
(3)
Le schéma réactionnel du couplage peptidique d’une amine primaire avec un acide carboxylique activé par le couple EDC/NHS est proposé en Figure II.2.
Chapitre II – Etudes de pré-vectorisation des SRPs
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Figure II.2. Schéma réactionnel du couplage peptidique par activation de l’acide carboxylique avec le couple EDC/NHS.L’EDC réagit avec l’acide carboxylique pour former un intermédiaire o-acylisourée instable et hautement réactif, susceptible de réagir à toute attaque nucléophile. L’amine primaire peut alors directement réagir avec cet intermédiaire pour former une liaison amide stable (Figure II.2, voie (3)). Cependant, les atomes d’oxygène de l’eau peuvent également jouer le rôle de nucléophile, conduisant à l’hydrolyse de l’ester o-acylisourée puis à la régénération de l’acide carboxylique initial (Figure II.2, voie (2)). Ces deux réactions peuvent se produire parallèlement : si l’amine primaire ne réagit pas avec l’intermédiaire o-acylisourée avant qu’il ne s’hydrolyse, le couplage peptidique en question ne peut plus avoir lieu. Afin de palier cette réaction secondaire non désirée, un deuxième agent de couplage est introduit dans le milieu : il s’agit du NHS (Figure II.2, voie (1)). L’ajout de NHS permet de transformer l’ester o-acylisourée en ester-NHS, dont la réactivité est comparable à celle des anhydrides (couplage rapide avec l’amine primaire), et ainsi d’augmenter considérablement le rendement de la réaction de couplage peptidique. Le produit final de cette réaction en deux étapes conduit à la formation d’une liaison amide stable.
II.1.3. Conditions de la réaction de couplage peptidique
Le pH de la solution affecte fortement la réaction de couplage peptidique. Les esters NHS ont des temps de demi-vie de l’ordre de quelques heures à pH physiologique (Hermanson, 2008). Leur réactivité vis-à-vis des amines augmente avec le pH, cependant, c’est aussi le cas de la réaction concurrente d’hydrolyse. Pour optimiser le rendement du couplage et minimiser les effets de l’hydrolyse, les nanoparticules et molécules à coupler doivent être maintenues aux concentrations les plus élevées possibles, de manière à augmenter les opportunités de rencontre entre les fonctions esters activées et les amines primaires, plutôt qu’avec les molécules d’eau (Hermanson, 2008).
EDC NHS Ester o-acylisourée, instable et très réactif Liaison amide stable Ester-NHS, semi-stable et très
réactif vis-à-vis des amines
Liaison amide stable Acide carboxylique
initial régénéré
(1)
(2)
(3)
Chapitre II – Etudes de pré-vectorisation des SRPs
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0 5 10 15 20 25 0 2 4 6 8 10 12 0,5 mM 1 mM 5 mM 10 mM Temps (h) Rel ax iv ité longitudinal e ( s -1.mM -1)Nakajima et al. ont démontré par ailleurs que le pH devait être compris entre 3,5 et 4,5 pour favoriser l’étape d’activation des fonctions acides carboxyliques (sous forme d’ions carboxylates) alors que des pH plus élevés sont nécessaires pour la formation de la liaison amide, de manière à éliminer la forme protonée de l’amine (Nakajima et al., 1995). Typiquement, cette deuxième étape de la réaction (étape de couplage peptidique) est réalisée à pH physiologique (pH 7,4) (Hermanson, 2008).
II.1.4. Réactions de couplage peptidique de petites molécules aux SRPs –
Stratégies de synthèse
II.1.4.1. Choix du solvant
Les synthèses de couplage peptidique sont réalisées à partir de SRPs lyophilisées. La première étape consiste nécessairement à redisperser les nanoparticules dans l’eau.
Les SRPs vectorisées étant destinées à être testées in vitro ou in vivo, l’eau apparaît comme le solvant le plus approprié pour les réactions de couplage peptidique de petites molécules aux SRPs.
Lorsque les molécules à greffer sont difficilement solubles dans l’eau ou lorsqu’elles sont présentées sous forme d’esters activés (esters NHS), elles sont préalablement dissoutes dans du DMSO (DMSO anhydre si ester activés) avant d’être ajoutées à la solution aqueuse de SRPs. Le DMSO sera éliminé ultérieurement, lors de la purification des nanoparticules, de manière à assurer la biocompatibilité in vivo des SRPs.
II.1.4.2. Concentration
Des études de vieillissement des SRPs en solution aqueuse à pH physiologique à 37°C ont permis d’évaluer la limite de concentration en GdIII pour laquelle les SRPs restaient stables (Figure II.3) (Mignot, 2012).
Figure II.3. Relaxivité longitudinale (r1) des protons de l’eau en présence de SRPs en fonction du temps et de la concentration en GdIII, à pH 7,4, à 37°C, à 1,4 Tesla. Adaptée de Mignot, 2012.