1. Préparation des extraits cellulaires de levures
Les extraits cellulaires de levures sont préparés par disruption des levures en phase exponentielle (DO600nm ~ 1) à la French Press dans du tampon 20 mM Tris HCl pH = 8, 200 mM NaCl, 5 mM MgCl2. Le lysat est clarifié par 20 min de centrifugation à 30 000 g. Leur concentration est quantifiée par la méthode de Bradford (Kit Biorad). Les extraits sont conservés à -80°C.
2. Préparation des ARN totaux de levures
Une quantité de cellules correspondant à dix unités de DO à 600 nm est resuspendue dans 200 µL de tampon d’extraction (50 mM Tris HCl pH = 7.5, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA). Trois cents microlitres de billes de verre sont ajoutés. Le mélange est ensuite vortexé 1 min, puis incubé 2 min dans la glace et de nouveau vortexé 1 min. Deux cents microlitres de tampon d’extraction, 50 µL de SDS 10% et 400 µL de Phénol/chloroforme sont ajoutés puis le mélange est vortexé 1 min. Après une incubation de 10 min à 65°C, le tout est centrifugé 5 min à 15 000 g. Toutes les protéines sont éliminées par deux extractions au phénol/chloroforme successives. Les ARN totaux sont ensuite précipités avec 2.5 volumes d’éthanol, 1/10ème du volume d’acétate de sodium 3 M pH = 4.8 et 10 µg de glycogène.
3. Sporulation et dissection des tétrades
Ce type d’expérience nous permet de tester la complémentation de l’absence d’un gène par notre gène d’intérêt. Dans un premier temps, les levures doivent être transformées par un plasmide exprimant le gène d’intérêt.
Transformation des levures :
Les levures sont cultivés à 30°C en milieu riche jusqu’à atteindre leur phase exponentielle (0.7-0.8 DO à 600 nm). La croissance est stoppée par leur centrifugation 5 min à 4000 g. Les cellules sont lavées avec 50 mL d’eau puis resuspendues dans 300 µL de la solution LiAc/TE (100 mM Lithium acétate, 10 mM Tris, 1 mM EDTA). Cinquante microlitres de levures traitées au LiAc sont mis en présence de 50 mg d’ADN de sperme de saumon, de 0.1-1 µg du plasmide d’intérêt et de 300 µL d’une solution de LiAc/TE/PEG (solution LiAc/TE additionnée de 40% de PEG 3350). Le mélange est inversé 3-4 fois et incubé 30 min à 30°C. Le choc thermique est ensuite réalisé 10 min à 42°C. Les levures sont ensuite lavées avec 1 mL d’eau, puis étalées sur un milieu sélectif.
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Ré-étaler les levures sur un milieu riche (YPG si le gène d’intérêt est sous le contrôle du promoteur GAL).
Sporulation en milieu carencé :
Ensemencer le milieu de sporulation (1 % acétate de potassium, 0.005% acétate de zinc, supplément URA 20 mg/L, supplément HIS 20 mg/L, supplément LEU 60 mg/L) avec une colonie. Incuber 5 jours à 25°C puis 4 jours à 30°C.
Dissection des tétrades :
Centrifuger 150 µL de culture 1 min à 6000 g. Le culot est lavé avec 150 µL d’eau stérile, puis repris dans 150 µL de sorbitol 1M avec 0,1 mg/mL de zymolyase 20T. Le mélange est incubé 15 minutes à 33°C (ajuster en fonction de la résistance des tétrades). La digestion est stoppée par 500 µL d’eau stérile froide, puis 40 µL sont étalés à gauche sur une boite YPG. Les spores sont ensuite séparées à l’aide d’un micromanipulateur (Singer MSM System série 200).
4. Immunoprécipitation des ARN de levures
Le protocole a été adapté du journal Current protocols in molecular biology en 2006.
Les levures sont cultivées dans 500 mL de YPG dans un erlenmeyer de 2 L, jusqu’à atteindre une croissance de 1 unité DO (1 unité de DO = 1,5 à 3 x107 cellules)
Une concentration de 0.5 à 2 X107 cellules/ mL est idéale. Le volume total de culture peut varier (min 50 mL). Classiquement 2 à 10 mL de culture de levure sont utilisés par immunoprécipitation.
Récolte des cellules et lyse des cellules
Les cellules sont centrifugées 5 min à 3000 g à 4°C, puis le culot est lavé deux fois avec 50 mL de PBS froid (0.81 mM Na2HPO4 x 2H2O, 0.147 mM KH2PO4, 13.7 mM NaCl, 0.27 mM KCl). Les cellules sont à nouveau centrifugées 5 min à 3000 g à 4°C et le culot est resuspendu dans du tampon de Lyse FA froid(50 unités DO/mL de tampon soit 7,5 à 15 x108 cellules/mL) (
Tampon de Lyse FA
50mM Hepes pH7.5 (avec KOH), 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100, 0.1% (w/v) Sodium deoxycholate
Autoclaver, conserver 1 an à température ambiante et avant utilisation ajouter 40 U Rnasin par mL (Ribolock RNase inhibitor, Fermentas) et des inhibiteurs de protéase.
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Les cellules sont ensuite lysées par leur disruption à la French press
Coupure des acides nucléiques et dégradation de l’ADN
Les extraits sont soniqués pendant 2 cycles de 15 sec avec 2 min de refroidissement entre chaque cycle à 50% d’amplitude. Puis à 500 µL d’extrait (soit 25 unités DO = 4 à 7 X108 cellules) sont ajoutés :
MgCl2 à 25 mM final (12,5 µL de 1M) CaCl2 à 5 mM final (5 µL de 1M) 3 µL RNasin (40U/µL)
6 µL DNase I (20 mg/mL)
Le mélange est ensuite incubé 15 min à 37°C. La réaction est stoppée avec 20 µL EDTA 0.5M (concentration final 20 mM). Les extraits sont centrifugés 5 min à 16 000 g ( Le surnageant peut être aliquoté à cette étape et conservé à -80°C plusieurs semaines). La taille des fragments d’ARN est contrôlée sur un gel polyacrylamide dénaturant (La taille des ARN doit être entre 100 et 1000 nucléotides, avec un maximum entre 300 et 500 nucléotides. Des fragments plus longs augmenteraient le bruit de fond et diminueraient la résolution de la région où la protéine est associée).
Immunoprécipitation
Le surnageant est dilué quatre fois dans le tampon FA (soit 0.2 -1 X 108 cellules ; 75 µL dans 250 µL de tampon FA) contenant de la RNasin. Un à cinq microlitres d’anticorps sont ajoutés à l’extrait et le mélange est mis en rotation sur une roue une nuit à 4°C.
Le mélange est ensuite centrifugé 15 min à 16 000 g à 4°C et le surnageant est transféré dans un nouveau tube. En parallèle, les billes A-Sépharose sont équilibrées avec du tampon FA contenant 1mg/mL BSA (acétylée RNase free) et 20 µL de billes sont ajoutés à l’extrait et incuber 1 à 2h sur une roue à 4°C.
Lavages des billes
Le mélange est centrifugé 2 min à 3000 g. Le surnageant est retiré et les billes sont resuspendues dans 700 µL de tampon FA à température ambiante. Le mélange est mis en rotation 3 min sur roue puis centrifugé 2 min à 3000g à température ambiante. Les billes sont ensuite lavées avec : 700 µL de tampon FA, puis de nouveau 700 µL de tampon FA, ensuite avec 1 mL de FA300 ou FA500, puis 700 µL de LiCl et pour terminer avec 700 µL TE/ NaCl 100 mM
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Tampon FA 500 ou 300 : 50mMHepes pH=7.5 (avec KOH), 500 ou 300 mMNaCl, 1 mM
EDTA, 1% (v/v) Triton X-100, 0.1% (w/v) Sodium deoxycholate (Autoclaver, conserver 2 mois à 4°C et avant utilisation ajouter 40 U Rnasin par mL)
Lavage LiCl : 10 mM Tris-HCl pH=8, 250 mM LiCl, 0.1% Sodium deoxycholate, 1 mM EDTA(Autoclaver, conserver 2 mois à 4°C et avant utilisation ajouter 40 U Rnasin par mL)
TE/NaCl 100 mM : 10 mM Tris-HCl pH=8, 1 mM EDTA , 100 mMNaCl
Elution des complexes ARN/protéines
L’élution des complexes est réalisé avec 75 µL de tampon d’élution ChIP
Tampon élution ChIP : 100 mM Tris-HCl pH=8, 10 mM EDTA,1% SDS (Autoclaver, conserver
1 an à température ambiante, avant utilisation ajouter 40 U RNasin par mL)
Le mélange est incubé 10 min à 37°C (bain-marie), puis centrifugé 2 min à 3000 g à température ambiante. L’éluat est transféré dans un nouveau tube et l’élution est répétée une seconde fois avec 75 µL de tampon d’élution.
Reverse du crosslink et purification des ARN
Six microlitres de NaCl 5 M (concentration finale 200 mM) contenant 20 µg de protéinase K sont ajoutés à l’éluat et le mélange est incubé 1h à 42°C (digestion des polypeptides crosslinker+ DNase) puis 1h à 65°C (réversion des crosslink). Cent microlitres d’H2O et 250 µL phénol acide/chloroforme pH=4.7 (5/1) sont ajoutés au mélange puis vortexer. La phase aqueuse est récupérée et les ARN sont précipités par l’ajout de 25 µL de sodium acétate 3 M pH=5.5, 20 µg de glycogène et 625 µL Ethanol absolu froid. Incuber à -80°C au minimum 1h.
La solution est ensuite centrifugée 30 min à 16 000 g à 4°C et le culot est lavé avec 500 µL d’éthanol 70%. Centrifuger 5 min à 16 000 g à 4°C
Les ARN sont ensuite resuspendus dans un volume compris entre 20 et 70 µL de TE pH=7.5.
5. Analyse des polysomes de levures
Le protocole est adapté selon Baim et al., 1985. Des levures sont cultivées en milieu riche jusqu’à atteindre une DO à 600 nm comprise entre 0.6 et 1. La croissance est stoppée par l’ajout de cycloheximide à 50 µg/mL. Les cellules sont incubées 5 min dans la glace avant d’être centrifugées 5 min à 4000 g à 4°C. La suite des manipulations se déroule dans la glace.
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Les cellules sont lavées deux fois avec 2 mL de tampon P (Tris HCl 10 mM pH = 7.4, NaCl 100 mM et MgCl2 30 mM additionné extemporanément de cycloheximide 50 µg/mL et d’héparine 200 µg/mL, tous deux fraîchement préparé). Après leur centrifugation 5 min à 4000 g, les cellules sont resuspendues dans 1 mL de tampon P en présence de 250 µL de billes de verre. Le mélange est vortéxé 8 x 15 s avec des pauses de 30 s. Un millilitre et demi de solution P est ajouté au lysat, puis il est centrifugé 5 min à 5000 g puis une seconde fois 5 min à 10 000 g. Trente unités d’absorbance à 260 nm sont fractionnées sur un gradient 15-50 % de sucrose. Le gradient de sucrose est préparé en parallèle avec le tampon G (50 mM Tris HCl pH=7.4, 50 mM NH4Cl, 12 mM MgCl2) dans des tubes de 10 mL spécifique au rotor SW41Ti. Ce dernier est préparé à l’aide de l’appareil Gradient master Biocomp avec les paramètres suivants : temps 1 : 38, angle 81.5, vitesse de rotation 18. Les extraits de levures sont centrifugés 2h30 à 40 000 g dans le rotor SW41Ti. Des fractions de 500 µL sont ensuite prélevées manuellement.