Perspectives de la collaboration

Le premier objectif de cette collaboration est d’identifier les m5C des ARNr de S.cerevisiae. Un échantillon d’ARN totaux extraits de la levure S.cerevisiae sera tout d’abord analysé avec les différentes paires d’oligonucléotides fonctionnelles. Le second objectif de cette collaboration est d’identifier les enzymes catalysant les m5C caractérisées. Pour cela, il suffit de comparer les profils

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des m5C en présence ou en absence du catalyseur putatif. Or, chez S.cerevisiae trois ARN : m5 C-méthyltransférases ont été identifiées Trm4p, Nop2p et Ynl022cp.

La protéine Trm4 est la seule RCMT de levure caractérisée. Elle catalyse la formation des m5C au niveau des ARNt à quatre positions : 34, 40, 48 et 49 (Motorin and Grosjean, 1999). L’activité des deux autres RCMT, que ce soit Nop2p ou Ynl022C n’a jamais été démontrée expérimentalement. Notre objectif est de localiser les m5C au niveau des ARNr d’une souche sauvage de S.cerevisiae, et de regarder par la suite si certaines m5C disparaissent au niveau des ARNr de souches mutantes (Figure II.23). Pour cela, nous disposons, d’une souche haploïde (∆YNL022c) dont le gène YNL022c a été délété (EUROSCARF numéro d’accession Y05348). Quant à Nop2p, le gène NOP2 étant essentiel, sa délétion dans une souche haploïde n’est pas viable. Aussi, nous nous sommes procurés des levures diploïdes ∆nop2 (une copie du gène NOP2

a été substituée par KANR, l’autre copie étant fonctionnelle) (Biovalley numéro de catalogue YSC1021-673611) que nous avons transformées par le p416GalS portant le gène codant la protéine Nop2 mutée au niveau des deux cystéines catalytiques (nommée Nop2DB). Cette souche a ensuite été mise en culture en milieu pauvre pour qu’elle entre dans un cycle de sporulation. Les tétrades formées ont ensuite été isolées puis les spores n’ayant pas le gène endogène NOP2 (résistance à la généticine) et portant le plasmide (URA3) ont été sélectionnées. Celles-ci étaient viables et ne possédaient plus l’activité méthyltransférase de Nop2. Les ARN totaux de cette souche ∆nop2/Nop2DB ont été préparés et seront également analysés par Mathias Schaefer.

La protéine Trm4 catalyse la formation des m5C au niveau des ARNt, néanmoins aucune activité n’a été recherchée au niveau des ARNr. C’est pourquoi, les ARNr d’une souche haploïde (∆TRM4) dont le gène YBL024W a été délété (EUROSCARF numéro d’accession 10114A) seront également analysés par la technique de conversion au bisulfite de sodium.

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Figure II.23 : Stratégie globale de recherche des 5-méthylcytosines des ARN de S.cerevisiae par la méthode de conversion au bisulfite de sodium.

Analyser les différents lots d'ARN permettrait d'attribuer les méthylations à chaque enzyme Ynl022c, Nop2 et Trm4. Les étoiles représentent les m5C. Les étoiles bleues sont catalysées par Trm4, les vertes par Ynl022c et les mauves par Nop2.

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3ème partie : La protéine Nop2 et son homologue humain p120

interviennent dans les étapes de maturation des ARN pré-ribosomiques conduisant à la production de l’ARNr 25/28S

I. Caractérisation du rôle des protéines Nop2 et p120 au

niveau de la biogenèse des ribosomes

La protéine Nop2 est requise pour la maturation du pré-ARNr 27S en ARNr 5,8S et 25S et pour la production de la sous-unité ribosomique 60S (Hong et al., 1997). La répression de l’expression de NOP2, entraîne l’accumulation de l’intermédiaire 27SB et un déficit de production de la sous-unité 60S. De manière intéressante, p120 interagit avec l’ARNr 28S par son domaine riche en arginines et est associée aux particules 60S et aux ribosomes assemblés (Gustafson et al., 1998), c’est pourquoi nous avons proposé que la protéine p120 interviendrait à cette même étape de la maturation des pré-ARNr. Différentes techniques ont été mises en place afin de caractériser leur rôle dans la synthèse des ribosomes.

La multiplication des cellules est un processus très régulé. Les cellules tumorales ont perdu ce contrôle et se multiplient beaucoup plus rapidement que des cellules saines. La multiplication des cellules nécessite la synthèse rapide de ces constituants cellulaires, en particulier des protéines. Ainsi, la machinerie de synthèse des protéines doit elle-même être présente en très grande quantité dans les tumeurs. La protéine p120, marqueur de l'évolution tumorale et de pronostic, est surexprimée dans de multiples tumeurs (Freeman et al., 1988). Un rôle au niveau de la biogenèse des ribosomes pourrait expliquer la nécessité d’une production abondante de cette protéine dans les cellules cancéreuses. L'hypothèse est que p120 jouerait un rôle dans la maturation des pré-ARNr soit au niveau de leurs clivages soit au niveau de leurs modifications chimiques. Pour déterminer l’étape à laquelle intervient p120, une première approche a été d’éteindre son expression dans des cellules humaines et de regarder le profil de maturation des pré-ARNr à l'aide de sondes spécifiques.

Un argument majeur en faveur de l’implication de p120 dans le processus de maturation des ARNr est que son homologue chez S.cerevisiae Nop2p a un rôle dans la synthèse de la sous-unité ribosomique 60S. Or, la levure est un modèle et un outil de choix pour des expériences de biologie moléculaire et de génétique. Donc travailler sur la protéine Nop2p en parallèle, devait me permettre de comprendre par une autre approche la fonction des protéines p120 et Nop2p.

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Notre système d’étude est composé d’une souche diploïde de levure ayant une seule copie fonctionnelle du gène NOP2 (∆nop2 (2N)). Cette souche peut être transformée par un plasmide permettant l’expression de la protéine p120 ou de protéines mutantes sous le contrôle du promoteur GalS (Figure III.1).

Figure III.1 : Principe du système d'étude des protéines p120 et Nop2 dans une souche de levure diploïde hétérozygote portant une seule copie fonctionnelle du gène NOP2.

Après sporulation de la souche non transformée, deux spores portent une copie fonctionnelle du gène NOP2, deux spores portent une copie non fonctionnelle. La distribution du plasmide au cours de la méiose est aléatoire, il est donc nécessaire de vérifier la présence d’une copie du plasmide dans chaque spore (marqueur d’auxotrophie). Lorsque la protéine codée par le plasmide ne complémente pas l’absence de Nop2p alors seules les deux spores portant la copie fonctionnelle du gène NOP2 sont viables. Dans le cas où la protéine codée par le plasmide est fonctionnelle, les quatre spores sont viables et les spores seront discriminées sur un milieu sélectif.

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Des alignements de séquences de Nop2 et p120 et les prédictions de structures secondaires ont permis de mettre en évidence quatre domaines distincts. Les domaines N- et C-terminaux présentent peu d’homologie de séquence et ne semblent pas être structurés. Au

contraire, les domaines catalytiques (CD) et les régions constantes (CR) sont fortement conservées, elles présentent 60 et 65% d’identité, respectivement. (Figure III.2).

Figure III.2 : Alignement des séquences protéiques des quatre domaines de Nop2p et de p120. Les protéines sont scindées en quatre domaines définis par homologie de séquences et par leur structures prédites à l'aide du serveur Predictprot : le domaine N-terminal (N-ter), la région constante

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(RC), le domaine catalytique (DC) et le domaine C-terminal (C-ter). Les domaines RC et DC sont les plus similaires avec 65 et 60% d'identité entre Nop2p et p120. Les lysines et les arginines sont indiquées par des tirets roses au niveau du domaine N-ter. Les cystéines catalytiques sont localisées par un astérique rouge.

Tous les domaines structuraux de Nop2p se sont avérés nécessaires à la croissance. Lorsque Nop2 est substituée par la protéine humaine p120, une croissance très lente est observée. Néanmoins, lorsque le domaine N-terminal et la région constante de p120 sont remplacés par ceux de Nop2p, le phénotype sauvage est rétabli. Ces protéines semblent donc avoir la même fonction mais le domaine N-ter de levure joue un rôle important pour la fonction de ces protéines chez la levure. Nous en concluons, que le domaine catalytique de p120 est fonctionnel dans la levure.

Plusieurs hypothèses peuvent expliquer l’activité sous optimale de la protéine humaine p120 entière :

 La protéine p120 est mal localisée chez la levure

 La protéine p120 n’interagit pas correctement avec son substrat

 L’activité de Nop2p nécessite son interaction avec un partenaire que p120 ne parvient pas à établir sans le domaine N-ter de levure

Les deux premières hypothèses ont été testées et les résultats sont présentés dans la publication qui suit. Une étude à grande échelle des intéractants physiques et génétiques de Nop2p (Costanzo et al., 2010; Gavin et al., 2002) a déjà été menée par la technique de Tandem Affinity Purification

(Puig et al., 2001 ; Xu et al., 2010) L’approche pour tester la dernière hypothèse consisterait à réaliser des expériences de double hybride afin de tester la spécificité des interactions physiques entre les deux protéines (directes ou non). Ces protéines seront sélectionnées en fonction des informations transmises sur la Saccharomycès Genome Database qui répertorie l’ensemble des intéractants de Nop2p (http://www.yeastgenome.org/). Des expériences d’immunoprécipitation pourront être réalisées avec des extraits de cellules humaines afin d’identifier également les partenaires de p120. Lorsque les partenaires auront été identifiés, l’expérience de complémentation par p120 en absence de Nop2 sera renouvelée en ajoutant le partenaire protéique humain de p120. Les résultats pourront apporter des informations complémentaires sur le fonctionnement des deux protéines.

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Le mécanisme de biogenèse des ribosomes est très complexe et fait intervenir plus de deux cents facteurs protéiques. Pour beaucoup d’entre eux, leur rôle exact n’est pas connu puisqu’ils sont uniquement fonctionnels dans le contexte de particules pré-ribosomiques. Trouver les interactants de Nop2 et p120 permettrait de déterminer à quelle(s) étape(s) ils interviennent et si leur fonction est connue, il serait alors important d’étudier le rôle de cette interaction.

La protéine p120 interagit avec la nucléophosmine. Malheureusement pour notre problèmatique, cette dernière est multifonctionnelle, elle intervient à la fois dans le transport et la biogenèse des sous-unités ribosomiques. Elle a également une activité chaperonne et elle intervient dans le remodelage de la chromatine et dans la duplication du centrosome (Okuwaki, 2008). La nucléophosmine pourrait intéragir avec p120 afin de permettre son transport dans le nucléole. Ou il est possible que cette interaction ait une autre signification : La nucléophosmine pourrait intervenir en duo avec la protéine p120 au niveau de la biogenèse des ribosomes. Cette dernière hypothèse est appuyée par le fait que La nucléophosmine a une activité ribonucléasique (Herrera et al., 1995). D’autant plus que in vitro, la nucléophosmine coupe spécifiquement les fragments contenant le 28S et le 5,8S et elle ne s’associe pas avec l’ARNr 18S. C’est pourquoi, elle a été proposée comme étant responsable du clivage des pré-ARNr en C2, étape à laquelle semble intervenir p120. La protéine p120 pourrait favoriser l’interaction entre l’ARNr et la nucléophosmine.

En parallèle, il serait interessant de réaliser des expériences d’ARN interférence pour éteindre l’expression du gène de la nucléophosmine et d’analyser les conséquences au niveau de la maturation des pré-ARNr par Northern blot et transcription inverse.