Les RCMT des Eucaryotes

Les différentes RCMT eucaryotes ont été classées en fonction de leur séquence et de leur spécificité de substrats. Jusqu’en 2009, la sous-famille I ne comprenait que des RCMT procaryote. Mais il a été montré que certaines RCMT eucaryotes appartiennent à cette sous-classe (Pavlopoulou and Kossida, 2009). Cependant la majorité des RCMT eucaryotes sont regroupées en quatre sous-familles : Nop2/Nol1 (sous-famille II), YebU/Trm4 (sous-famille III), PH1991/NSUN(6) (sous-famille IV) et RCMT9 (sous-famille V). Seule la protéine Trm4 humaine et la Trm4p de S. cerevisiae ont été caractérisées. Très peu de données existent actuellement sur les autres sous-familles.

a) Trm4 (Ncl1)

La protéine Ncl1 a été initialement découverte chez S.cerevisiae comme étant une protéine nucléaire de fonction inconnue (Wu et al., 1998). Les études biochimiques menées par la suite ont démontré que Ncl1 catalyse la méthylation des ARNt à quatre positions : 34, 40, 48 et 49 (Motorin and Grosjean, 1999). Les m5C 34 et 40 sont respectivement uniquement catalysées sur les précurseurs des ARNtLeu (CAA) et les ARNtPhe(GAA). Lorsque le gène TRM4 est délété, les ARNt ne possèdent plus aucune m5C. Ncl1p est donc la seule enzyme de S.cerevisiae à catalyser la formation des m5C au niveau des ARNt. Elle a alors été renommée Trm4 pour tRNA-specific MTase 4. Des expériences de mutagenèse dirigée ont permis de mettre en évidence le rôle catalytique de la cystéine 310 du motif VI (Walbott et al., 2007b). Des expériences de digestions protéasiques à la trypsine ont confirmé que seul le domaine N-terminal était important pour la méthylation de la cytosine, bien que le domaine C-terminal stimule considérablement son activité (Walbott et al., 2007a).

27

Une protéine homologue humaine a été identifiée par un alignement de séquences : hTrm4 ou Misu/NSUN2. Elle intervient dans la voie d’activation de la prolifération cellulaire induite par Myc dans les cellules tumorales. En effet, NSUN2 est trouvée en faible quantité dans des cellules épidermiques normales, alors qu’elle est surexprimée dans les cellules cancéreuses (Frye and Watt, 2006). Elle est alors phosphorylée par Aurora-B, une kinase du cycle cellulaire, ce qui affecte son activité MTase et son association avec les protéines nucléaires (la nucléoline et la nucléophosmine) (Sakita-Suto et al., 2007). Alors que la séquence de NSUN2 présente 35% d’identité avec la séquence de la Trm4 de levure, NSUN2 catalyse uniquement la méthylation de la position 34 au niveau du précurseur de l’ARNtLeu (CAA) (Brzezicha et al., 2006). Les autres ARNt-MTases humaines catalysant les m5C en position 48, 49 et 50 ne sont pas encore identifiées.

b) Nop2p et p120

Nop2p, membre de la sous-famille II des RCMT chez S.cerevisiae, est une protéine nucléolaire essentielle impliquée dans la biogenèse de la sous-unité 60S du ribosome (Hong et al., 1997). Cette fonction, donnant sans doute à Nop2 son caractère essentiel, sera détaillée par la suite. L’activité MTase de Nop2p n’a jamais été démontrée expérimentalement. Cette sous-famille de protéines NSUN/NOP2/NOL1 est très fortement représentée chez l’homme, puisque aujourd’hui neuf MTases ont été identifiées : NSUN1 à 7, NSUN5A, B et C. La plupart de ces gènes sont conservés chez les Mammifères. De nombreux isoformes des ARNm sont transcrits à partir de chacun de ces gènes et engendre la production de nombreux variants protéiques. La plupart de ces variants présentent le domaine m5C-MTase putatif avec les deux cystéines catalytiques. La conservation de cette sous-famille au cours de l’évolution des eucaryotes et les nombreux membres retrouvés chez les mammifères reflètent l’importance de ces RCMT. Cependant, leur rôle n’a encore pas été élucidé.

Un fragment de la protéine NSUN5A a été cristallisé et sa structure a été déterminée à haute résolution (code PDB : 2B9E). NSUN5 montre une forte similarité de séquence avec la troisième RCMT putative de S. cerevisiae codée par l’ORF YNL022C, qui est très peu caractérisée (sous-famille I). La protéine Ynl022c présente les motifs caractéristiques des RCMT, cependant son activité MTase n’a jamais été montrée expérimentalement et son substrat n’est pas identifié. Mise à part pour la protéine NSUN2, aucune étude n’a été menée sur l’activité et la spécificité de substrat de ces enzymes. Il serait donc intéressant de comprendre pourquoi autant de variants protéiques sont synthétisés, d’autant plus que certains de ces gènes sont impliqués dans

28

différentes maladies. Par exemple, le syndrome de William-Beuren est une maladie génétique due à une microdélétion chromosomique. Le phénotype associé est une anomalie du développement accompagnée d’un comportement caractéristique de l’individu affecté. Parmi les 18 gènes délétés se trouvent NSUN5A, B et C (Doll and Grzeschik, 2001).

NSUN7 illustre également l’implication des RCMT dans diverses maladies, puisqu’une mutation dans ce gène entraine la réduction de motilité des spermatozoïdes et la stérilité chez une souris mâle (Harris et al., 2007).

c) Cas particulier de Dnmt2 et de ses homologues

Les protéines Dnmt2 sont les protéines les plus conservées de la famille des ADN : m5 C-MTases (DNMT). De manière surprenante, bien que possédant tous les motifs caractéristiques, aucune activité ADN : MTase n’a initialement été démontrée. De plus, des cellules souches embryonnaires (« embryonic stem cells », ES), exprimant des mutants de Dnmt2, ne présentent pas de variation du taux de méthylation de leur ADN. La conservation de Dnmt2 chez les eucaryotes et la présence de plus d’une dizaine d’homologues chez les Protistes, les Plantes, les Champignons et les Mammifères montrent l’importance de cette enzyme. En conséquence, d’autres investigations ont été menées afin d’élucider l’activité ADN : m5C-MTase de Dnmt2 (Schaefer and Lyko, 2010). Cependant, cette activité n’est pas spécifique, peu efficace et non processive. Il est également intéressant de constater que certains organismes comme les nématodes présentent un gène Dnmt2 alors que leur ADN n’est pas méthylé. Ces dernières données suggèrent fortement que Dnmt2 a une fonction supplémentaire. Cette hypothèse a été vérifiée puisque Dnmt2 méthyle la position 38 de l’ARNtAsp (Goll et al., 2006). Cette nouvelle activité efficace et très spécifique démontre que Dnmt2 est une RCMT.

Des expériences de mutagenèses ont été menées récemment afin de comprendre comment une ADN : m5C-MTase peut catalyser la formation des m5C dans les ARN (Jurkowski et al., 2008). Dnmt2 représente une enzyme non canonique de sa famille et pose alors la question : est-ce que d’autres ADN : m5C-MTases sont capables de méthyler des ARN ?

29