ribosomes
1. Régulation de la disponibilité des protéines ribosomiques
Soixante dix neuf protéines forment le ribosome des mammifères. Leurs gènes se trouvent sur des chromosomes différents et ils sont exprimés dans tous les tissus. Tous les gènes codant les protéines ribosomiques et pré-ribosomiques sont transcriptionnellement co-régulés comme « Ribi regulon » par les mêmes facteurs cis et trans. Ces membres des régulons Ribi portent une séquence polypyrimidine appelé 5’TOP en 5’ de leur ARNm (Mayer and Grummt, 2006). Cette séquence est utilisée pour réguler leur traduction. Lorsque les cellules sont quiescentes, ces ARNm sont stockés dans le cytoplasme sous forme de particules ribonucléoprotéiques inactives. Lors d’une activation de la croissance, ces ARNm sont recrutés au niveau des polysomes pour être traduits. Cette stimulation augmente l’affinité des ribosomes pour les ARNm possédant la séquence 5’TOP. A ce jour, le mécanisme expliquant les variations d’affinité du ribosome est encore méconnu.
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Les protéines ribosomiques sont régulées aussi bien au niveau traductionnel que transcriptionnel. Les gènes des protéines ribosomiques sont transcrits par l’ARN polymérase II et sont régulés de manière coordonnée avec les ADNr en réponse au stress et aux conditions de croissance. Ce mécanisme complexe implique Fhl1p, le coactivateur Ifh1p, le corépresseur Crf1p et la voie de signalisation TOR (Xiao and Grove, 2009). Fhl1p est localisée au niveau des promoteurs des gènes codant les protéines ribosomiques, et recrute, soit Ifh1p, soit Crf1p.
La voie de « ras-cAMP-protein kinase A » (PKA) régule également la transcription des gènes des protéines ribosomiques. Lors de son activation par des changements nutritionnels, le taux des ARNm codant les protéines ribosomiques varie.
La quantité de protéines ribosomiques est également contrôlée par la modulation du temps de demi-vie des ARNm (Warner, 1999).
2. Régulation de la synthèse de l’ARNr 5S
L’ARNr 5S est synthétisé par l’ARN polymérase III. Son activité transcriptionnelle est également couplée à la croissance. Quatre voies de signalisation (TOR, MAPK, Myc et pRb) sont connues pour ajuster les besoins de la cellule en ARNr 5S en fonction des conditions environnementales (Goodfellow and White, 2007). Ces quatre systèmes de régulation agissent au niveau du facteur de transcription TFIIIB. Ce facteur est essentiel au recrutement et au positionnement de l’ARN polymérase III au niveau du site d’initiation des gènes cibles.
IV. Dérégulation de la biogenèse des ribosomes et cancer
Un cancer est la conséquence d’anomalies successives qui perturbent de façon permanente la prolifération cellulaire (Montanaro et al., 2008). Dans la cellule cancéreuse, il y a une rupture de l'équilibre entre les signaux intracellulaires : activation des voies stimulatrices et suppression des voies inhibitrices. La coexistence de plusieurs événements est nécessaire à la transformation tumorale. Les données de ces dernières années suggèrent un rôle actif de la biogenèse des ribosomes dans la tumorigénèse (Montanaro et al., 2008; Ruggero and Pandolfi, 2003). Le nucléole est la région du noyau dédiée à la biogenèse des ribosomes. Les caractéristiques d’une cellule cancéreuse sont une hypertrophie du nucléole, un taux de transcription des ADNr élevé et une synthèse protéique importante. Les changements morphologiques du nucléole sont associés à une dérégulation de la synthèse des ribosomes corrélée à la multiplication anarchique des cellules cancéreuses. Est-ce la prolifération non
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contrôlée des cellules qui provoque la perturbation de la synthèse des ribosomes ou est-ce l’inverse ?
Il faut remarquer que les protéines impliquées dans le contrôle de la prolifération cellulaire (c-Myc, pRb…) régulent aussi la biogenèse des ribosomes (Schlosser et al., 2003). Leurs gènes sont altérés dans de nombreux cancers. La mutation ou la délétion d’un d’entre eux entraînent la perte du contrôle du cycle cellulaire. Prenons l’exemple de c-Myc. Ce facteur est nécessaire et suffisant à l’entrée dans le cycle cellulaire. Comme décrit précédemment, il régule positivement l’activité transcriptionnelle de l’ARN polymérase I et l’expression de nombreuses protéines nucléolaires impliquées dans la biogenèse des ribosomes. c-Myc est surexprimée dans de nombreux cancers, ce qui a pour conséquence, d’amplifier la transcription des ADNr et d’augmenter le nombre de ribosomes.
De la même façon, les cyclines D et E sont surexprimées dans certains cancers, le facteur UBF est alors suractivé et la transcription par l’ARN polymérase I est augmentée (Drygin et al., 2010; Lempiainen and Shore, 2009; Mayer and Grummt, 2006).
Au contraire des proto-oncogènes, les gènes suppresseurs de tumeurs sont inactivés. pRb contrôle le passage de la phase G1 à la phase S. Lorsqu’il est hypophosphorylé, il fixe le facteur UBF et empêche la transcription des ADNr. Sa phosphorylation progressive, au cours du cycle cellulaire par Cdk4/Cycline D ou Cdk2/cycliine E, induit une augmentation graduelle du taux d’ARNr. La perte de pRB ou son hyperphosphorylation (en cas de surexpression des cdk ou des cyclines) entraîne la levée de l’inhibition du cycle cellulaire.
Par le même processus, l’inactivation de p53 provoque l’absence de son contrôle négatif de la synthèse des ribosomes. Ces exemples démontrent que l’augmentation de la quantité de ribosomes est une conséquence d’un changement fonctionnel d’un proto-oncogène ou d’un gène suppresseur de tumeur contrôlant le cycle cellulaire.
Cependant, il est envisageable que la perturbation de la synthèse des ribosomes peut induire la transformation néoplasique des cellules (Montanaro et al., 2008; Ruggero and Pandolfi, 2003). En effet, certains facteurs comme l’alcool, des protéines virales, provoquent la stimulation de l’activité nucléolaire et va faciliter la progression tumorale. Le ribosome est le centre de traduction des ARNm. Un accroissement du taux de ribosomes non coordonné à la division cellulaire, provoque une augmentation de la synthèse de certaines protéines. Des proto-oncogènes, des facteurs anti-apoptotiques ou/et des facteurs de croissance peuvent être ainsi surexprimés et induire la transformation tumorale.
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Objectifs de ma thèse
Les objectifs de ma thèse ont été, d’une part, de rechercher l’activité méthyltransférase des protéines Nop2 et p120 par la mise en place de différentes techniques : une méthode de détection des m5C basée sur l’emploi du bisulfite couplée à une analyse par transcription inverse (Gu et al,
2005), une autre approche basée sur des tests de méthylation in vitro en présence de SAM tritiée avec les protéines recombinantes produites et purifiées chez E.coli. D’autre part, mon projet visait à comprendre le mode d’action de Nop2p et de p120 au niveau de la maturation des pré-ARNr par des approches de génétique chez la levure et d’ARN interférence dans des cellules humaines.
Dans un premier temps, les sites putatifs de méthylation des cytosines ont été identifiés par des alignements bioinformatiques de séquences des ARNr. Dans un deuxième temps, la méthode de conversion des cytosines en uraciles par le bisulfite de sodium a été mise en œuvre afin de localiser les m5C au niveau des ARNr de S.cerevisiae. Seules les cytosines méthylées en position 5 sont protégées de cette réaction, ce qui permet de les localiser ensuite par des expériences de transcription inverse.
En parallèle, l’approche basée sur l’emploi de SAM tritiée a été mise au point avec la ARN : m5C-MTase de S.cerevisiae Trm4p. Cette méthodologie m’a permis alors de tester l’activité de Nop2p et de p120 sur différents substrats.
L’équipe d’Aris a démontré que Nop2p est requise pour la maturation du pré-ARNr 27S en ARNr 5,8S et 25S et pour la production de la sous-unité ribosomique 60S (Hong et al., 1997). La répression de l’expression de NOP2, entraîne l’accumulation de l’intermédiaire 27S et un déficit de production de la sous-unité 60S. De manière intéressante, p120 interagit avec l’ARNr 28S par son domaine riche en arginines et est associée aux particules 60S et aux ribosomes assemblés (Gustafson et al., 1998), d’où l’hypothèse à vérifier, est-ce que p120 intervient comme Nop2p dans la biogenèse des ribosomes ? Cette proposition est en accord avec une expression précoce de p120 en phase G1, car la cascade de réactions qui conduit à la fabrication des ribosomes est l’un des premiers événements qui survient lorsque la cellule entre en phase G1. L’hypothèse d’une intervention de p120 dans la biogenèse des ribosomes était aussi en accord avec un rôle possible dans la prolifération tumorale. En effet, la capacité de produire des ribosomes détermine l’habileté de la cellule à croître et à proliférer. Pour cela, un système de complémentation a été mis en place avec une souche ∆nop2 de S.cerevisiae. Cette souche diploïde possède une copie intacte du gène NOP2, celui-ci étant essentiel, et la seconde copie du gène
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cette souche, seules deux spores sur quatre sont viables (celle possèdant la copie du gène NOP2). Les levures sont alors transformées par un vecteur permettant l’expression de mutants de Nop2p ou de p120. Si la protéine exprimée complémente l’absence de Nop2p, lors de la sporulation, les quatre spores seront viables. Nous pouvions alors observer si la protéine Nop2 pouvait être substituée par la protéine humaine p120 et définir la fonction des domaines structuraux de Nop2p et de p120 préalablement déterminés par des alignements de séquences et des prédictions de structures secondaires.
Une approche d’ARN interférence a été mise en place afin de comprendre le rôle de p120 dans la biogenèse des ribosomes. Puis, l’effet de l’extinction de son expression dans des cellules humaines, a été analysé par des expériences de Northern blot et de transcription inverse.
Nop2p et p120 ont un domaine MTase et semblent avoir un rôle au niveau de la maturation des pré-ARNr. De ce fait, une question implicite se posait : ces deux activités sont-elles liées ? L’activité méthylase de ces protéines est-elle importante pour une biogenèse des ribosomes correcte ? Pour cela, il a été nécessaire de supprimer l’activité méthylase des protéines en mutant les cystéines catalytiques et d’analyser les conséquences au niveau de la croissance des cellules et de la maturation des pré-ARNr.
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I. Matériel