Recherche des m 5 C putatives des ARNr de S.cerevisiae

Les modifications post-transcriptionnelles des ARNr sont conservées au cours de l’évolution, elles sont localisées dans les régions fonctionnelles importantes des ribosomes, notamment, au niveau du centre peptidyltransférase ou de la région de décodage. Leur nombre augmente avec la complexité de l’organisme, avec une centaine de modification chez la levure et environ deux cents chez l’homme. Cependant, ce n’est pas ce qui est actuellement observé pour les m5C. En effet, seulement trois ont été retrouvées au niveau des ARNr humains alors que six ont été localisées chez Thermus thermophilus. E.coli présente une seule m5C au niveau de leur ARNr 23S et trois ont été identifiées au niveau de l’ARNr 28S humain (Figure II.2 et II.3).

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Figure II.2 : Représentation des 5-méthylcytosines au niveau du domaine IV des

ARNr 23/25/28S de six espèces procaryotes et eucaryotes. La structure de l’ARNr 25S

est représentée schématiquement sous forme de fil de fer bleu foncé. Les m5C identifiées sont représentées par des ronds roses et les m5C putatives sont représentées par des ronds verts. Les 2'O-méthylations sont représentées par des carrés orange. Les autres types de modifications sont représentés par des ronds bleus.

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Figure II.3 : Représentation des 5-méthylcytosines au niveau du domaine V des

ARNr 23/25/28S de cinq espèces procaryotes et eucaryotes. La structure de l’ARNr 25S

est représentée schématiquement sous forme de fil de fer bleu foncé. Les m5C identifiées sont représentées par des ronds roses et les m5C putatives sont représentées par des ronds verts. Les 2'O-méthylations sont représentées par des carrés orange. Les autres types de modifications sont représentés par des ronds bleus.

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L’ARNr 16S des bactéries contient deux à cinq m5C, tandis qu’aucune m5C n’a été détectée au niveau de l’ARNr 18S eucaryote (Figure II.4).

Figure II.4 : Représentation des 5-méthylcytosines au niveau des ARNr 16/18S de cinq espèces procaryotes et eucaryotes. La structure de l’ARNr 18S est représentée schématiquement sous forme de fil de fer rouge. Les m5C identifiées sont représentées par des ronds roses et les m5C putatives sont représentées par des ronds verts. Les 2'O-méthylations sont représentées par des carrés orange. Les autres types de modifications sont représentés par des ronds bleus.

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Chez les levures, seule une analyse partielle de l’ARNr de S.carlsbergiensis a été réalisée et a permis de localiser un résidu m5C dans le domaine IV de l’ARNr 25S (Veldman et al., 1981) (Figure II.2). L’ensemble de ces données nous a permis de déterminer les positions putatives des m5C au niveau des ARNr 18S et 25S de S.cerevisiae (Figures II.2, II.3 et II.4). Ainsi, quatre positions de m5C ont été prédites au niveau de l’ARNr 18S et trois au niveau de l’ARNr 25S. Des oligonucléotides ont alors été sélectionnés afin de réaliser les expériences de transcription inverse au niveau de ces régions d’ARNr avant et après le traitement chimique (Figures II.5, II.6 et II.7) : 5410/5411, 5412/5413, 5414/5415, 5416/5417 (Non converti/Converti).

Figure II.5 : Schéma des oligonucléotides de RT-PCR au niveau du domaine IV de l'ARNr 25S de S.cerevisiae. Les séquences surlignées par des flèches bleues sont reconnues par les oligonucléotides écrits en vert lorsque les ARN ne sont pas traités au bisulfite et par les oligonucléotides écrits en mauve lorsque les cytosines des ARN sont substituées par des uraciles. Les m5C putatives sont encerclées en vert.

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Figure II.6 : Schéma des oligonucléotides de RT-PCR au niveau du domaine V de l'ARNr

25S de S.cerevisiae. Les

oligonucléotides dessinés en vert reconnaissent les séquences d’ARN non traitées au bisulfite de sodium. Les oligonucléotides dessinés en mauve s’hybrident aux ARN dont les cytosines sont converties en uraciles. Les séquences surlignées par des flèches bleues sont reconnues par les oligonucléotides écrits en vert lorsque les ARN ne sont pas traités au bisulfite et par les oligonucléotides écrits en mauve lorsque les cytosines des ARN sont substituées par des uraciles. Les m5C putatives sont encerclées en vert.

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Figure II.7 : Schéma des oligonucléotides de RT-PCR au niveau de l'ARNr 18S de

S.cerevisiae. Les oligonucléotides dessinés en vert reconnaissent les séquences d’ARN non traitées au

bisulfite de sodium. Les

oligonucléotides dessinés en mauve s’hybrident aux ARN dont les cytosines sont converties en uraciles. Les séquences surlignées par des flèches bleues sont reconnues par les oligonucléotides écrits en vert lorsque les ARN ne sont pas traités au bisulfite et par les oligonucléotides écrits en mauve lorsque les cytosines des ARN sont substituées par des uraciles. Les m5C putatives sont encerclées en vert.

Les oligonucléotides 5410, 5412, 5414 et 5416 sont non convertis c’est-à-dire qu’ils s’hybrident à l’ARN lorsque les cytosines sont présentes. Les oligonucléotides 5411, 5413, 5415 et 5417 sont convertis, ils s’hybrident à l’ARN lorsque les cytosines ont été substituées par des uraciles. Les premières expériences de transcription inverse ont été réalisées avec des ARN totaux extraits de S.cerevisiae afin de tester l’efficacité des oligonucléotides.

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Figure II.8 : Expériences d'extension d'amorce suivie d'un séquençage des différents domaines de l'ARNr 25S et 18S de S.cerevisiae. Cinq µg d'ARN totaux de levures sont incubés avec 10 pmol d'oligonucléotides pendant 10 min à 65°C puis 10 min dans la glace. La transcriptase inverse est ajoutée puis l'élongation a lieu une heure à 42°C en présence de dideoxynucléotides. Les échantillons sont ensuite analysés sur un gel polyacrylamide dénaturant 7%. Le résultat est visualisé par autoradiographie. Les séquences d'ARN et des oligonucléotides sont indiqués à coté de chaque autoradiographie avec les m5C putatives encerclées en vert.

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Les oligonucléotides 5410 et 5416 sont fonctionnels, l’oligonucléotide 5412 s’hybride mais permet une élongation moins efficace. En revanche, l’oligonucléotide 5414 est inefficace, il semble que la structure de cette région d’ARN soit trop stable pour être rétrotranscrite.