Synthèses préparatives de COs-(N) par le procédé VC1280

Les oligomères CO-IV, CO-V et CO-VI obtenus à partir du mélange commercial de chitosane (Chapitre III « Accès aux chitinoligosaccharides »), sont traités par la CD VC1280 pour

obtenir des précurseurs d’analogues de LCOs puis par une β-N-acétylhexosaminidase

(Aspergillus oryzae) afin de fournir les précurseurs naturels de LCOs. Au total, quatre oligomères sont ciblés au cours de cette synthèse par le « procédé VC1280 » (Figure 78).

Figure 78. Obtention des précurseurs de LCOs et de leurs analogues par le procédé VC1280.

Les chitinpentaose et chitintétraose N-désacétylés en position non-réductrice sont deux

molécules correspondant aux squelettes saccharidiques de l’immense majorité des facteurs Myc et des facteurs Nod. Leur synthèse est réalisée en deux étapes, par l’action séquentielle

de la CD et de l’hexosaminidase. Enfin, leurs équivalents N-désacétylés en pénultième

position à partir de l’extrémité non-réductrice seront des précurseurs d’analogues de LCOs, et leur synthèse fait intervenir uniquement la CD VC1280.

II.3.1. Précurseur d’analogues de LCOs

Les oligomères sont mis en solution dans du carbonate d’ammonium 10 mM pH 7,9, en

présence de VC1280 (V. cholerae). L’enzyme, stockée dans du tampon phosphate de

potassium 20 mM pH 8, est préalablement dialysée contre ce même carbonate d‘ammonium 10 mM pH 7,9. Ce sel est volatil, au contraire du tampon utilisé pour son stockage, et cela va faciliter les étapes de purification des oligosaccharides.

Le milieu réactionnel est placé à 37°C pendant 20 heures, sans agitation. En utilisant un ratio enzyme / substrat égal à 0,2 % (mol/mol), on obtient des réactions totales comme l'indique l'analyse par CCM en fin de réaction (Figure 79), et cela sans problème de dénaturation ou d'inhibition de l’enzyme par l'acide acétique co-produit de la réaction. Une inhibition compétitive par ce produit a déjà été observée chez une CD de champignon (Ki =

0,3 mM)193. Une autre étude a même montré qu’en présence d’une très forte concentration

en acétate de sodium (3 M), une réaction inverse peut se réaliser grâce à la CD C.

lindemuthianum, et un oligomère de chitosane peut être partiellement N-acétylé194.

193 Jaworska, M. M., 2011, Biotechnol. J., 6, (2), 244-247.

194 Tokuyasu, K., Ono, H., Mitsutomi, M., Hayashi, K. and Mori, Y., 2000, Carbohydr. Res., 325, (3), 211-215.

Figure 79. Analyse par CCM de la N-désacétylation des COs par la CD VC1280.

(a) Chitintétraose (1) Standard CO-IV (2) Standard CO-IV(N^IV) (3) Produit de l’action de VC1280 sur CO-IV (brut réactionnel) (b) Chitinpentaose (4) Standard CO-V (5) Standard CO-V(N^V) (6) Produit de l’action de VC1280 sur CO-V

(brut réactionnel) (c) Chitinhexaose (7) Standard CO-VI (8) Produit de l’action de VC1280 sur CO-VI (brut réactionnel). Eluant : butanol / éthanol / eau (4/3/3).

Ces études pouvaient laisser penser que des conditions de synthèses quantitatives ne soient pas forcément accessibles. Il semble au contraire que la CD VC1280 ne soit pas gênée ici par les 2 mM d’acide acétique, présents au maximum en fin de réaction.

Les standards utilisés pour suivre les réactions ne sont pas N-désacétylés sur la même

position que les produits de la CD VC1280. Cela n’influence par la mobilité des COs-(N) dans les systèmes d’éluants décrits ici.

Le standard CO-VI(NV) n’est pas disponible au laboratoire, mais néanmoins, on observe une

différence de migration entre le produit de la réaction et le standard CO-VI (Figure 79c) équivalente aux différences de migration observées sur le chitintétraose et le chitinpentaose

(Figure 79a et Figure 79b), laissant supposer que la réaction de N-désacétylation a bien eu

lieu. Le milieu réactionnel est ensuite placé à 100°C pendant 10 min afin de dénaturer l’enzyme qui est ensuite éliminée par centrifugation.

Substrat ^Quantité (mg) ^Produit Quantité (mg) Rendement (%) CO-VI 5,1 CO-VI(N^V) 3,9 79 CO-V 19,1 CO-V(N^IV) 16,6 91

CO-IV 18,7 CO-IV(N^III) 17,3 97

L’oligomère N-désacétylé est alors en solution dans du carbonate d’ammonium, et par lyophilisation, le sel s’évapore, laissant un produit purifié. Ce protocole limite au maximum les manipulations, ce qui permet d’obtenir de très bons rendements en produits isolés (Tableau 14). Le produit purifié est alors caractérisé par spectrométrie de masse haute résolution, ainsi que par HPLC, afin de s’assurer de sa pureté et de l’absence de sels. Ces précurseurs d’analogues de LCOs sont obtenus en une seule étape.

II.3.2. Précurseurs de LCOs

Après action de la CD VC1280 (V. cholerae), celle de la β-N-acétylhexosaminidase (A. oryzae)

va permettre d’accéder aux précurseurs naturels de LCOs (Figure 78). Cette enzyme est un

contaminant mineur de la β-galactosidase (A. oryzae) commerciale195.

Une solution enzymatique commerciale est préparée puis dialysée à travers une membrane

de 10 kDa. La taille de la β-N-acétylhexosaminidase étant de 67,5 kDa, cela doit permettre

d’éliminer des sels et autres petits contaminants présents dans le mélange commercial, et

donc de faciliter la purification du produit final. L’oligomère N-désacétylé en pénultième

position est alors placé en réaction. Par une analyse CCM, le suivi de la réaction semble indiquer une conversion quantitative (Figure 80). L’unité GlcNAc libérée n’est pas identifiable sur la CCM, mais la réaction s’observe facilement par la différence de migration

entre substrats et produits. Le CO-IV(NIV) généré (Figure 80, piste 4) possède bien le même

facteur de rétention (RF) que le standard CO-IV(NIV) (Figure 80, piste 2, flèche noire).

Figure 80. Analyse par CCM de l’action de la β-N-acétylhexosaminidase (A. oryzae) sur des COs-(N). (1) Standard CO-V(N^V). (2) Standard CO-IV(N^IV). (3) Produit de l’hexosaminidase sur CO-VI(N^V )(brut réactionnel). (4) Produit de

l’hexosaminidase sur CO-V(N^IV)(brut réactionnel). Eluant : propanol / eau / ammoniaque 27% (70/30/1).

Substrat ^Quantité (mg) ^Produit Quantité (mg) Rendement (%) CO-VI(N^V) 4 CO-V(N^V) 2,1 66 CO-V(N^IV) 3,9 CO-IV(N^IV) 1,4 43

Tableau 15. Bilan de synthèse des précurseurs de LCOs obtenus par le « procédé VC1280 ».

Le même raisonnement s’applique pour le CO-V(NV) (Figure 80, piste 3), qui présente le

même RF que le standard CO-V(NV) (Figure 80, piste 1, flèche rouge). Les bruts réactionnels

révèlent de nombreux contaminants, malgré la dialyse de l’extrait protéique. L’efficacité de cette dernière parait donc limitée, perturbant l’analyse par CCM. La conversion des substrats en produits semble totale, mais des traces de substrat de départ ne permettent pas de l’affirmer totalement.

La purification du précurseur de LCO s’effectue en deux étapes. Premièrement, le milieu réactionnel est de nouveau dialysé contre une membrane de 10 kDa afin d’isoler le CO(N) des protéines. Ensuite, afin de séparer le précurseur de LCOs du GlcNAc libéré, le CO(N) est précipité dans l’acétone, puis resuspendu dans de l’eau et lyophilisé. Le produit purifié est alors caractérisé par spectrométrie de masse haute résolution, ainsi que par HPLC, afin de s’assurer de sa pureté et de l’absence de sels. Les différentes analyses confirment la réaction de l’hexosaminidase et la formation de précurseurs de LCOs. Les COs-(N) sont purs à homogénéité. Ces derniers sont obtenus avec de bons rendements en produits isolés (Tableau 15).

II.3.3. Précurseur de LCO sulfaté

La CD VC1280 n’est pas décrite pour être active sur des COs fonctionnalisés à l’extrémité réductrice. Ayant à disposition des COs sulfatés sur le sucre réducteur par l’action couplée

des sulfotransférases NodH (S. meliloti) et AST-IV (R. norvegicus) (Chapitre IV « Décoration

des chitinoligosaccharides »), des tests d’activité à échelle analytique ont été réalisés. En suivant le protocole défini pour les oligomères non fonctionnalisés, la CD VC1280 présente une activité similaire sur un CO-V(S). L’analyse par spectrométrie de masse (Figure 81a) confirme la formation d’un précurseur d’analogue de LCO sulfaté.

Ce précurseur analogue est ensuite placée en réaction avec la β-N-acétylhexosaminidase (A.

oryzae) afin d’accéder à un précurseur naturel de LCOs. L’hydrolyse du résidu non-réducteur est réalisée dans les mêmes conditions que pour les oligomères non

S) (Figure 81b). Le procédé VC1280 est donc également opérationnel sur des précurseurs fonctionnalisés par un groupement sulfate sur le sucre réducteur.

(a)

(b)

Figure 81. (a) Spectre de masse MALDI-ToF (mode positif) de N-désacétylation du CO-V(S) par la CD VC1280. (b) Spectre de masse MALDI-ToF (mode positif) de l’action de la β-N-acétylhexosaminidase(A. oryzae) sur le