Souches et plasmides

I.2.1. Méthodologie ... 76 I.2.2. Clonage de NolO (Sinorhizobiumfredii NGR234A) ... 77 I.2.3. Clonage de l’Aryl sulfotransférase IV (Rattus norvegicus) ... 77 I.2.4. Clonage de NodH (Sinorhizobium meliloti) ... 77 I.2.5. Clonage de VC1280 (Vibrio cholerae) ... 77 I.2.6. Clonage de NodB (Sinorhizobium meliloti) ... 77 I.3. Préparation des bactéries compétentes et transformation ... 78

II. Expression des protéines sous forme recombinante ... 79

II.1. Expression chez Saccharomyces cerevisiae ... 79 II.1.1. Transformation ... 79 II.1.2. Expression ... 79 II.2. Expression chez Pichia pastoris ... 80 II.2.1. Transformation ... 80 II.2.2. Expression ... 80 II.3. Expression chez Escherichia coli ... 80

III. Techniques de biochimie ... 82

III.1. Préparation des fractions cytosoliques ... 82 III.2. Préparation des fractions périplasmiques... 82 III.3. Purification sur résine de nickel ... 82 III.4. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS ... 83 III.5. Tests d’activité des enzymes ... 83 III.5.1. Tests d’activité de la chitinase C2 (O.xanthineolytica) ... 83 III.5.2. Tests d’activité de NolO (Sinorhizobium fredii NGR234) ... 84 III.6. Dosage des activités chitine N-désacétylases ... 84 III.6.1. Chitine N-désacétylase VC1280 (Vibrio cholerae) ... 84 III.6.2. Chitine N-désacétylase NodB (Sinorhizobium meliloti) ... 84 III.6.3. Dosage des amines libres ... 85

IV. Préparation des Substrats ... 86

IV.1. Préparation de la chitine colloïdale ... 86 IV.2. Préparation des oligomères de chitine ... 86

V. Purification des oligomères de chitine N-désacétylés (COs-(N)) ... 88

V.1. Procédé VC1280 ... 88 V.2. Procédé NodB ... 88

VI. Techniques chromatographiques ... 90

VI.1. Chromatographie sur couche mince de silice ... 90 VI.2. Chromatographie d’exclusion stérique ... 90 VI.3. Chromatographie en phase liquide haute performance ... 90

VII. Techniques physico-chimiques ... 91

VII.1. Spectrométrie de masse ... 91 VII.2. Résonnance magnétique nucléaire (RMN) ... 91

I. Techniques de biologie moléculaire

I.1. Souches et plasmides

Les souches utilisées pour les clonages et pour l’expression de protéines recombinantes sont regroupées dans le Tableau 1.

Souches Caractéristiques Référence

Clonage

Escherichia coli

TOP10

Souche utilisée pour les clonages et la propagation des plasmides. Permet un nombre élevé de copies des plasmides.

Life technologies

Expression chez la levure Saccharomyces

cerevisiae

EBY100

Système d’expression eucaryote, capable de réaliser des modifications post-traductionnelles telles que la N- et la O -glycosylation, la phosphorylation et la formation des ponts disulfures.

Invitrogen

Pichia pastoris

GS115

Système d’expression eucaryote, capable de réaliser des modifications post-traductionnelles comme la N- et la O -glycosylation, la phosphorylation et la formation des ponts disulfures. Cette levure est methylotrophique, c’est-à-dire capable de métaboliser le méthanol comme seule source de carbone.

Life technologies

Expression chez la bactérie

Escherichia coli

BL21

Souche de référence pour l’expression de protéines recombinantes, déficiente en protéases OmpT et Lon. La désignation (DE3) signifie que la souche porte une copie chromosomale du gène de l’ARN polymérase T7 sous le contrôle du promoteur lacUV5 et donc inductible à l’IPTG.

Invitrogen

Escherichia coli

BL21 plysS

Souche portant le plasmide pLysS, et de ce fait résistante au chloramphénicol. L’expression basale de la protéine recombinante est limitée grâce à une inhibition de l’expression basale de l’ARN polymérase T7 par le lysozyme T7.

Invitrogen

Escherichia coli

BL21 STAR

La stabilité des ARNm est augmentée grâce à la mutation rne131 de la RNase E. Peu adaptée à l’expression des gènes toxiques, car elle possède une plus forte expression basale que la BL21.

Invitrogen

Escherichia coli

BL21 Rosetta

Porte le plasmide pRARE, et donc une résistance au chloramphénicol. Ce plasmide code pour des ARNt rares chez E. coli, permettant d’augmenter le niveau d’expression pour des gènes non optimisés chez E. coli.

Novagen

Les différentes souches d’E. coli utilisées pour l’expression recombinante de protéines

dérivent de la BL21 (DE3)55. Ces souches sont capables d’accumuler en grande quantité des

protéines exprimées par induction à l’isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).

Les plasmides utilisés pour les clonages et pour l’expression des protéines sont regroupés dans le Tableau 2. Les différents plasmides pET sont utilisés comme plasmides d’expression

chez E. coli. Ils possèdent le promoteur du phage T7 inductible à l’IPTG pour réguler

l’expression des protéines recombinantes (Novagen).

Plasmide Résistance Caractéristiques Référence

Clonage

pCR4Blunt-TOPO Amp / Kan

Plasmide utilisé comme vecteur de sous-clonage, bien adapté pour le séquençage et utilisé pour la ligation des produits PCR.

Invitrogen (Figure 21)

Expression chez la levure

pESC-Leu Amp

L’expression du gène cloné dans ce plasmide est sous le contrôle de promoteurs GAL, inductibles au galactose. Il possède un marqueur d’auxotrophie à la leucine (LEU2).

Agilent Technologies

(Figure 22)

pPICZαA Zéocine

L’expression du gène cloné dans ce plasmide est sous le contrôle du promoteur AOX1 inductible au méthanol. Le facteur α permet la sécrétion dans le milieu de culture de la protéine, exprimée avec une étiquette poly-histidine (poly-His) en C-terminale.

Invitrogen (Figure 23)

Expression chez la bactérie

pET20b(+) Amp

La protéine peut être exprimée chez E. coli au sein du périplasme (grâce à la séquence pelB leader en N-terminale) et avec une étiquette poly-His en C-terminale.

Novagen (Figure 24)

pET21d(+) Amp

La protéine peut être exprimée chez E. coli au sein du cytoplasme avec une étiquette poly-His en C-terminale et une étiquette T7 en N-C-terminale.

Novagen (Figure 25)

pET26b(+) Kan

La protéine peut être exprimée chez E. coli au sein du périplasme (grâce à la séquence pelB leader en N-terminale) et avec une étiquette poly-His en C-terminale.

Novagen (Figure 26)

pET28a(+) Kan

La protéine peut être exprimée chez E. coli au sein du cytoplasme avec une étiquette poly-His en N et C-terminale et une étiquette T7 en N-C-terminale.

Novagen (Figure 27)

pET32a(+) Amp

La protéine peut être exprimée chez E. coli au sein du cytoplasme en fusion avec la thioredoxine. Une séquence poly-His relie les deux protéines en fusion et une étiquette poly-His supplémentaire est présente en C-terminale.

Novagen (Figure 28)

Tableau 2. Caractéristiques des plasmides utilisés dans l'étude.

Figure 21. Schéma du vecteur pCR4Blunt-TOPO et carte de restriction du site de clonage multiple.

Figure 22. Schéma du vecteur pESC-LEU et carte de restriction du site de clonage multiple.

Figure 24. Schéma du vecteur pET20b(+) et carte de restriction du site de clonage multiple.

Figure 26. Schéma du vecteur pET26b(+) et carte de restriction du site de clonage multiple.

Figure 28. Schéma du vecteur pET32a-c(+) et carte de restriction du site de clonage multiple.