La chitine N -désacétylase VC1280 ( Vibrio cholerae )

En plus d’un accès aux précurseurs naturels des LCOs, l’utilisation de l’activité de la CD

VC1280 (V. cholerae) permettrait d’obtenir également des analogues de précurseurs de

LCOs. Ces derniers posséderaient en effet une amine libre en pénultième position à partir de l’extrémité non-réductrice, permettant d’y fixer une chaine grasse (Figure 74). Cela pourrait fournir des indications sur l’importance de la position de la chaine grasse sur le squelette chitinoligosaccharidique, quant à l’activité biologique de ces analogues non-naturels.

II.2.1. Expression et purification de VC1280

L’expression de la CD VC1280 chez E. coli BL21 a été décrite174, et l’enzyme recombinante

possède une étiquette poly-histidine à son extrémité C-terminale, qui a permis sa purification sur résine de nickel. Ce travail sert de base pour l’étude. Différentes conditions

d’expression chez la bactérie E. coli BL21 ont donc été testées (Tableau 13), et la qualité de

la surexpression est évaluée par analyse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes. La présence de la protéine d’intérêt est estimée avant et au cours de l’induction, sous sa forme soluble.

La souche E.coli BL21 est transformée par le plasmide pET26b_VC1280, contenant le gène

vc1280 fusionné au peptide signal pelB qui permet d’exporter la protéine au sein du

périplasme de la bactérie lors de sa production. Avec cette construction, la CD VC1280 (V.

cholerae) possède également une séquence poly-histidine à son extrémité C-terminale afin de la purifier par chromatographie IMAC sur résine de nickel.

L’analyse des extraits cytoplasmiques sur SDS-PAGE révèle la surexpression d’une protéine à une taille observée (46,1 kDa) en accord avec la taille attendue de la CD VC1280 (48 kDa) (Figure 75, pistes 5 à 8). La meilleure condition d’expression à 20°C nécessite 22 heures d’induction, et 0,05 mM d’IPTG (Figure 75, piste 8). Une culture de bactérie E. coli BL21, transformée par le pET26b(+) est réalisée, et aucune protéine surexprimée dans les mêmes conditions n’est observée (Figure 75, pistes 1 à 4).

Malgré son expression périplasmique, la purification de la CD VC1280 (V. cholerae) n’utilise

pas un protocole pour extraire uniquement les protéines de ce compartiment cellulaire. En effet, au cours de la préparation de ces fractions, une perte significative de CD a été observée. Ainsi, il nous est paru préférable de casser les bactéries à l’aide d’un disrupteur de cellules pour extraire la CD en une seule étape, afin d’augmenter le rendement de production.

Souche d’expression ^{Plasmide Température}

Inducteur

(IPTG) Temps d’induction

BL21 (DE3) pET26b(+) 30 °C 0,5 mM 2, 5 et 22 heures 20°C 0,5 mM 0,1 mM 0,05 mM 2, 4 et 22 heures

Figure 75. Analyse par SDS-PAGE 10% de l'expression de la CD VC1280 (V. cholerae) chez E. coli BL21. (1-4) Protéines cytoplasmiques d’E. coli BL21 transformées par le pET26b(+) après 0, 2, 4 et 22 heures de croissance

à 20°C, avec 0,05 mM d’IPTG.(5-8) Protéines cytoplasmiques d’E. coli BL21 transformées par le pET26b_VC1280 après 0, 2, 4 et 22 heures de croissance à 20°C, avec 0,05 mM d’IPTG. (9) CD VC1280 purifiée sur résine de nickel.

(environ 20 µg de protéines déposés par piste).

La protéine surexprimée est fixée sur résine de nickel, puis éluée avec des solutions concentrées en imidazole (50 à 150 mM). La protéine purifiée présente quelques contaminants de masses moléculaires inférieures à celle-ci, mais elle reste majoritaire à 77% (Figure 75, piste 9).

Le rendement moyen de purification est de 120 mg de CD VC1280 par litre de culture d’E.

coli transformée par le pET26b_VC1280. La protéine purifiée est dialysée contre du tampon

phosphate de potassium 20 mM pH 8 et stockée à -80°C sans ajout de glycérol ou de sels. Dans ces conditions, l’enzyme est stable plusieurs mois.

II.2.2. Caractérisation biochimique

Avant d’envisager des études de synthèse de précurseurs de LCOs, une caractérisation

biochimique de la CD VC1280 (V. cholerae) est menée. Cette étude est réalisée à travers un

test de dosage des amines libres au 3-méthyl-2-benzothiazolinone hydrazone (MBTH)61. Ce

dosage en point final fait intervenir au total cinq réactifs afin de former un complexe avec une glucosamine possédant un maximum d’absorbance à 655 nm. Le mécanisme probable

de cette réaction de coloration a été proposé192.

Lors de chaque mesure d’activité, une gamme étalon est réalisée. Pour des raisons

d’accessibilité des substrats, l’action de la CD VC1280 (V. cholerae) sur un oligomère de

chitine sera dosée avec de la β-N-acétyl-D-glucosamine (GlcN) comme référence pour la

gamme étalon.

Figure 76. Gammes étalon du dosage de la GlcN et du CO-V(N) par le MBTH.

Il peut exister un biais lors du dosage d’une activité de N-désacétylation d’oligomères de

chitine si la gamme étalon est faite avec le monomère GlcN. Il est donc nécessaire de s’assurer d’avoir une réponse identique du dosage lorsqu’on utilise un monomère ou un oligomère.

Deux gammes étalons sont ainsi réalisées en parallèle, l’une avec de la GlcN et l’autre avec

du CO-V(NV) (Figure 76). Respectivement, les valeurs de pente calculées sont 0,00412 M-1

et 0,00396 M-1, traduisant un écart de seulement 4 % entre le monomère et le pentamère.

Les réponses au dosage sont donc équivalentes, et l’utilisation de la glucosamine pour doser l’activité de la CD sur un oligomère ne présente pas de biais, au moins jusqu’au substrat chitinpentaose.

La caractérisation biochimique de l’enzyme a été réalisée sur du chitinbiose et les valeurs

retenues ont été mesurée au moins trois fois (Figure 77). La CD VC1280 (V. cholerae)

présente un Km de l’ordre du mM, ce qui traduit une affinité assez moyenne pour le chitinbiose qui est son meilleur substrat. L’erreur standard concernant la détermination du Km n’est pas négligeable (20%).

Figure 77. Représentation de Michaelis-Menten et paramètres biochimiques de la CD VC1280 (V. cholerae) sur le CO-II, déterminés par le dosage des amines libres au MBTH. (Concentration en enzyme = 0,39 nM)

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 0 100 200 300 400 500 600 700 800 A 6 5 5 n m GlcN (µM) Gamme étalon GlcN 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 100 200 300 400 500 600 700 800 A 6 5 5 n m CO-V(NV) (µM) Gamme étalon CO-V(NV)

Le substrat utilisé, probablement contaminé par des espèces contenant déjà des amines libres, provoque un bruit de fond conséquent. Les limites de sensibilité du test ont été atteintes et de ce fait, il n’a pas été possible d’augmenter la concentration en substrat initial au-delà de 3 mM. Cela aurait permis de réduire l’erreur standard sur la valeur du Km.

L’efficacité catalytique (kcat/Km) de la CD VC1280 (V. cholerae) sur le CO-II est relativement

faible et il faudra probablement utiliser une grande quantité d’enzyme afin d’obtenir des conditions de synthèse satisfaisantes. Cependant, au regard de la grande quantité d’enzyme

disponible lors de son expression recombinante chez E. coli, son utilisation reste néanmoins

prometteuse.

Les constantes catalytiques calculées ici par le dosage des amines libres diffèrent de celles

déjà décrites. Lors de la première caractérisation biochimique de la CD VC1280174, l’affinité

présentée pour le CO-II est de l’ordre du µM, et le kcat atteint presque une valeur de 30 s-1.

Au final, l’efficacité catalytique est 10000 fois plus importante que la nôtre. Lors de la

résolution de la structure tridimensionnelle de VC1280186, un troisième jeu de données

indique une affinité pour le chitinbiose plutôt de l’ordre du mM (0,69 mM), et une constante

catalytique autour de 4 s-1. Ainsi, l’efficacité catalytique est 50 fois supérieure à la valeur de

l’étude.

Pour chaque cas, la méthode choisie pour détecter l’activité de N-désacétylation diffère. La

première caractérisation174 dose l’activité par radioactivité à l’aide de CO-II comportant du

tritium. Dans le travail décrivant l’étude cristallographique186, la formation de CO-II(NI) est

quantifiée par HPLC-MS. Enfin, notre étude quantifie la formation des amines libres, par dosage colorimétrique. Ces techniques de détection d’activité peuvent expliquer les différences observées entre les constantes catalytiques décrites. Nos valeurs obtenues par dosage colorimétrique se rapprochent cependant des valeurs de l’étude cristallographique. Enfin, il est à noter que les deux autres études confirment une diminution de l’efficacité

catalytique lorsque le DP du substrat augmente, jusqu’au CO-VI pour Li et al174 et jusqu’au

CO-IV pour Martinez et al186.