Synthèse préparative de chitinoligosaccharides sulfatés

L’objectif est maintenant d’utiliser les deux STs NodH et AST-IV pour une sulfatation à l’échelle préparative à partir d’oligomères de chitine précédemment obtenus (Chapitre III « Accès aux chitinoligosaccharides). Cela permettra d’élargir la gamme de LCOs à des LCOs

Figure 66. CCM de l'action de NodH sur le CO-V

(1) Standard CO-V (flèche rouge) (2) Standard CO-V(S) (flèche noire)

(3) Produit de l’action de la ST NodH (couplée à l’AST-IV) sur le CO-V (brut réactionnel).

Eluant propanol / eau / ammoniaque 30 % (70/30/1)

Pour mettre en place ce remodelage enzymatique, un seul substrat est choisi, le chitinpentaose. La synthèse est réalisée sur 12 mg de CO-V. L’oligomère CO-V est mis en

présence des sulfotransférases NodH (S. meliloti) et AST-IV (R. norvegicus) pendant 20

heures à 25°C. En utilisant des ratios AST-IV / substrat de 3 % (mol/mol) et NodH/ substrat de 0,15 % (mol/mol), on observe une réaction pratiquement quantitative à en juger par l’analyse CCM (Figure 66, piste 3). Le rapport frontal est équivalent au standard CO-V(S) (Figure 66, piste 2). L'analyse chromatographique indique également la présence de traces du produit de départ (Figure 66, piste 3, flèche rouge).

Afin de confirmer cette observation, des analyses par spectrométrie de masse sont réalisées sur les extraits réactionnels bruts. En analyse Maldi mode négatif, on observe uniquement le produit sulfaté, le substrat étant indétectable (Figure 67a). En analysant en mode positif, l’ensemble des COs sont détectés, c’est-à-dire le substrat et le produit de la réaction (Figure 67b).

La spectrométrie de masse n’étant pas quantitative, on ne peut se fier à l'intensité des pics pour avoir une idée de la proportion relative des espèces dans le mélange, même si celles-ci sont de nature proche. On constate en effet une différence importante entre l'intensité des tâches en CCM et celle des pics en spectrométrie de masse, avec une proportion apparente de substrat de départ plus faible par CCM. Il est également possible qu'une dé-sulfatation partielle se produise durant l'analyse par spectrométrie de masse.

Le milieu réactionnel brut, contenant les CO-V(S), n’est pas traité immédiatement, et le produit n’est donc pas purifié. Le remodelage de cet oligomère va se poursuivre par une

(a)

(b)

Figure 67. (a) Spectre de masse MALDI-TOF (mode négatif) du CO-V(S) (b) Spectre de masse MALDI-TOF (mode positif) du CO-V(S).

V. Conclusion

Dans ce travail, deux décorations de chitinoligosaccharides par voie enzymatique ont été envisagées.

La première est la décoration par O-carbamoylation de l’extrémité non-réductrice des COs.

Cette étude a pour objectifs, d’une part de réaliser une étude biochimique de la CT NolO, et d’autre part de produire à échelle préparative des COs carbamoylés. Ces derniers auraient constitué une base pour accéder à des LCOs carbamoylés. Le rôle de cette décoration aurait alors pû être étudié et mieux compris. Très peu connue et étudiée jusqu’à présent, la

carbamoyltransférase NolO de Sinorhizobium fredii NR234A a été produite par voie

recombinante chez E. coli. La mise au point de conditions d’expressions cytoplasmiques a

permis une production élevée de la carbamoyltransférase avec un rendement de purification de 200 mg par litre de culture de bactérie transformée par le pET20b_nolO. La protéine a été purifiée sur résine de nickel. Aucune activité n’a été observée par la suite, que ce soit en utilisant l’enzyme purifiée, ou celle présente dans les extraits bactériens bruts. Un séquençage N-Terminale est en cours afin de valider l’identité de la protéine surexprimée.

La seconde décoration est la sulfatation en O-6 de l’extrémité réductrice des COs, réalisée

par la sulfotransférase NodH. La stratégie retenue implique l’utilisation couplée des

sulfotransférases NodH (S. meliloti) et arylsulfotransférase IV (R. norvegicus), mettant en jeu

un cycle de régénération du cofacteur PAPS. La comparaison de conditions d’expressions cytoplasmiques a permis une production élevée de la sulfotransférase de rat avec un rendement de purification de 180 mg par litre de culture de bactérie transformée par le pET28a_AST-IV. En revanche, concernant la ST NodH et malgré un travail conséquent

d’expression, l’enzyme est produite plus difficilement chez E. coli. Seulement six mg

d’enzyme sont purifiés par litre de culture de bactéries transformées par le pET21a_nodH. Il existe de très nombreuses possibilités afin d’améliorer le rendement de production de la ST NodH. Parmi les premières, l’utilisation d’une séquence génomique optimisée pour

l’expression chez la bactérie E. coli. Des travaux plus élaborés sur le positionnement des

étiquettes d’aide à la purification, voir l’expression de l’enzyme en fusion avec la

thiorédoxine pourrait avoir une influence sur le niveau d’expression147. Le milieu de

production TB est également une voie envisageable, tout comme la possibilité d’utiliser d’autres organismes hôtes tels que les levures.

147 Lavallie, E. R., Diblasio, E. A., Kovacic, S., Grant, K. L., Schendel, P. F. and McCoy, J. M., 1993, Bio-Technology, 11, (2), 187-193.

Cependant, toutes ces voies proposées afin d’augmenter le niveau de production de la sulfotransférase NodH se rapproche plus du développement, que d’un travail de recherche. Il était important ici de mettre en place le cycle de sulfatation des COs, impliquant une régénération du PAPS à partir de PAP. En effet, un chitinpentaose sulfaté a été synthétisé à l’échelle de la dizaine de mg, sans être encore purifié. Le but de ce produit sulfaté est de

l’utiliser comme substrat pour des enzymes de type chitine N-désacétylases, et même de

réaliser en une seule étape de synthèse la formation d’un précurseur de LCOs sulfaté. Nous disposons donc avec ce produit de matériel suffisant pour développer notre approche d’accès à des précurseurs de LCOs.

CHAPITRE V

A

CCES AUX

I. Rappels bibliographiques ... 170

I.1. Les chitine N-désacétylases ... 170