Modes d’action

Les CDs fongiques, bactériennes et d’archées présentent des modes d’action différents. Les

degrés de N-désacétylation peuvent aller d’une seule hydrolyse sur une position spécifique

de l’oligomère de chitine à des attaques multiples pour amener à la formation d’un

173 Ohishi, K., Yamagishi, M., Ohta, T., Motosugi, M., Izumida, H., Sano, H., Adachi, K. and Miwa, T., 1997, Biosci. Biotechnol. Biochem., 61, (7), 1113-1117.

174 Li, X., Wang, L.-X., Wang, X. and Roseman, S., 2007, Glycobiology, 17, (12), 1377-1387.

175 Sakamoto, Y., Kuno, E., Tomiyama, A., Hirano, T., Kumaki, Y., Tanaka, A., Kanda, H., Furuya, K., Hakamata, W., Oku, T. and Nishio, T., 2009, J. Appl. Glycosci., 56, 273-276.

176 Kadokura, K., Sakamoto, Y., Saito, K., Ikegami, T., Hirano, T., Hakamata, W., Oku, T. and Nishio, T., 2007, Biotechnol. Lett., 29, (8), 1209-1215.

177 Tanaka, T., Fukui, T., Atomi, H. and Imanaka, T., 2003, J. Bacteriol., 185, (17), 5175-5181.

178 Tanaka, T., Fukui, T., Fujiwara, S., Atomi, H. and Imanaka, T., 2004, J. Biol. Chem., 279, (29), 30021-30027.

179 Koga, S., Yoshioka, I., Sakuraba, H., Takahashi, M., Sakasegawa, S., Shimizu, S. and Ohshima, T., 2000, J. Biochem., 128, (6), 1079-1085.

oligomère de chitosane composé uniquement d’unités β-D-glucosamines (GlcN).

I.2.1. Schéma de N-désacétylation

I.2.1.1. Attaques multiples

La CD ClCDA (C. lindemunthanium) a une activité particulière, de type « endo », dépendant

directement du degré de polymérisation du substrat CO180. Par exemple, sur un CO-II, seule

l’extrémité non-réductrice sera N-désacétylée, alors que sur un CO-IV, selon un schéma

réactionnel défini, l’oligomère complet sera N-désacétylé après quatre attaques successives

(Figure 70a). L’utilisation combinée de β-N-acétylhexosaminidase (EC 3.2.1.52) et de β-D

-glucosaminidase (EC 3.2.1.165), qui hydrolysent respectivement des résidus β-N

-acétylglucosaminyles et des résidus β-glucosaminyles à partir de l’extrémité non-réductrice

du CO181, permet d’identifier sans ambiguïté les produits de réaction de la CD.

La chitine N-désacétylase de M. rouxii, a été testée sur des oligomères de chitine (II à

CO-VII) et est décrite comme étant de type « exo ». Ainsi, elle est capable de N-désacétyler un

chitintétraose en partant de l’extrémité non réductrice pour aller jusqu’à l’extrémité réductrice, en présentant une activité « processive » (Figure 70b).

Figure 70. Mode de N-désacétylation d’un chitintétraose par (a) une « endo » CD (C. lindemuthianum) (b) une « exo » CD (M. rouxii), d’après Zhao et al.¹⁵².

180 Tokuyasu, K., Mitsutomi, M., Yamaguchi, I., Hayashi, K. and Mori, Y., 2000, Biochemistry, 39, (30), 8837-8843.

Cependant selon le DP du substrat (CO-III, CO-VI et CO-VII), l’unité réductrice peut rester

intacte182. Ce schéma d’attaque multiple se retrouve donc plutôt chez les enzymes de

champignons et n’est pas adapté à des fins de synthèse de précurseurs de LCOs.

I.2.1.2. Attaque unique

Les enzymes identifiées comme des « mono-N-désacétylases » sont regroupées dans le

Tableau 12. D’après la littérature, il y a trois enzymes candidates pour notre application de synthèse de précurseurs de LCOs, possédant un DP de quatre ou cinq. Parmi elles, on

retrouve l’enzyme responsable de la N-désacétylation de l'oligomère de chitine lors de la

biosynthèse des LCOs, NodB.

CD ^{Schéma de} N-désacétylation

Substrats

Réf. GlcNAc CO-II CO-III CO-IV CO-V CO-VI NodB (S. meliloti) ^{nt nt} 27 Tk-Dac (T. kodakaraensis) ^nt 178 Pf-Dac (P. furiosus) ^{nt nt nt nt} 183 Ph-Dac (P.horikoshii) ^{nt nt nt nt} 183 ChbG (E. coli) ^{nt nt nt} 165 VC1280 (V. cholerae) 174 Pa-COD (V. parahemoltyicus) 176 COD (Vibrio SN184) 175 DA1 (V. alginolyticus) 173 DA2 (V. alginolyticus) 173

Tableau 12. Schéma de N-désacétylation et substrats de CDs. nt : non testé.

182 Tsigos, I., Zydowicz, N., Martinou, A., Domard, A. and Bouriotis, V., 1999, Eur. J. Biochem., 261, (3), 698-705.

183 Mine, S., Niiyama, M., Hashimoto, W., Ikegami, T., Koma, D., Ohmoto, T., Fukuda, Y., Inoue, T., Abe, Y., Ueda, T., Morita, J., Uegaki, K. and Nakamura, T., 2014, FEBS J., 281, (11), 2584-2596.

La nature et l’activité de cette enzyme en font le candidat naturel pour notre application. De

même la Tk-Dac (T. kodakaraensis) présente une activité sur l’extrémité non-réductrice

jusqu’au CO-V, ainsi que sur le monomère GlcNAc, au contraire de NodB. Enfin, parmi les

CDs de Vibrio, seule la CD VC1280 (V. cholerae) a été décrite possédant une activité allant du

chitinbiose (CO-II) au chitinhexaose (CO-VI), avec une efficacité dépendante de la longueur du substrat.

I.2.2. Les cations métalliques

L’influence des cations métalliques, notamment Zn2+, sur l’activité des CDs a été mise en

évidence dans de nombreuses études. Cependant, il est possible que des dications métalliques puissent selon la CD étudiée inhiber l’activité.

Les chitine N-désacétylases de champignons sont décrites comme étant des

métallo-protéines184. Dès la toute première description de chitine N-déacétylase159, les effets des cations ont été étudiés et il a été observé que l’utilisation d’éthylène diaminetétraacétique (EDTA) à 10 mM réduit l’activité relative de l’enzyme à 14%. Lors de la résolution de la

structure tridimensionnelle de la CD de C. lindemuthinaum, un atome de zinc a été identifié

dans le site actif162.

Chez les archées, la résolution de la structure tridimensionnelle de la CD Pf-Dac (Pyrococcus

furiosus) et de la CD Ph-Dac (Pyrococcushorikoshii) a révélé la présence d’un atome de zinc

au cœur du site actif183. Pour cette dernière, ainsi que pour la TK-Dac (T.kodakaraensis), il

n’est fait état d’aucun ajout de zinc dans le milieu réactionnel pour observer une activité185.

Cela laisse à penser que le cation métallique s’intègre à la structure de l’enzyme lors de sa production et ne peut être extrait par la suite. Ainsi, il n’est pas nécessaire de supplémenter le milieu réactionnel pour observer une activité.

Alors que trois CDs de Vibrio ont été clonées et produites par voie recombinante chez E. coli,

aucune d’entre elles ne nécessite l'addition de cations pour son activité C’est avec la

résolution de la structure tridimensionnelle de la CD VC1280 (V. cholerae) qu’un atome de

zinc a été observé, enchâssé dans le site actif186. Etrangement, la première caractérisation

biochimique de la CD VC1280 ne mentionne aucune influence de l’EDTA sur l’activité de

184 Ghormade, V., Kulkarni, S., Doiphode, N., Rajamohanan, P. R. and Deshpande, M. V., 2010, Current Research, Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology, A. Méndez-Vilas, Ed. 1054-1066.

185 Mine, S., Ikegami, T., Kawasaki, K., Nakamura, T. and Uegaki, K., 2012, Protein Expr. Purif., 84, (2), 265-269.

186 Andres, E., Albesa-Jove, D., Biarnes, X., Moerschbacher, B. M., Guerin, M. E. and Planas, A., 2014,

l’enzyme, et une sensibilité marquée aux cations métalliques174.

Enfin, concernant NodB (S meliloti), l’unique étude in vitro de l’enzyme décrit une forte

inhibition par les cations métalliques27. En s’intéressant aux autres CDs décrites, mais

également aux autres enzymes de la famille CE-4 dont plusieurs structures ont été résolues, de nombreux indices laissent à penser que cette enzyme possède une activité cation dépendante. Il est possible que le métal soit enchâssé dans la structure, et donc non-labile, comme pour la CD VC1280.