Structures des domaines I et V seuls 21

La formation de l’interaction kissing-loop I/V, ainsi que le réarrangement du substrat sont deux événements dépendant du magnésium qui peuvent être reproduits avec les domaines I et V isolés, sans le reste du ribozyme [109]. De ce fait, dans le but de mieux comprendre la reconnaissance du substrat et l’interaction kissing-loop I/V, les domaines I et V ont été isolés du reste du ribozyme et étudiés indépendamment par spectroscopie RMN. Jusqu’à maintenant, ces études ont permis de caractériser la conformation du domaine V et les formes inactive et active du substrat.

Domaine V

Deux études RMN ont permis de caractériser le domaine V seul, aussi appelé

SLV (stem-loop V, SLV) en absence (SLVfree, [113]) et en présence de magnésium (SLVMg, [114]). Ces études ont démontré que la boucle terminale V adopte un motif de type U-turn, dont la séquence consensus UNR implique les nucléotides U696, G697 et A698. De plus, la présence de magnésium entraîne deux effets principaux sur la conformation de la boucle V : un motif U-turn plus compact et un important changement de la position du nucléotide U700 [113, 114].

Tout d’abord, la boucle V en absence de magnésium adopte un motif de type U-

turn comprenant plusieurs des caractéristiques principales d’un U-turn canonique : la

séquence consensus UNR (U696-G697-A698), le changement de direction abrupte dans le squelette ribose-phosphate entre les nucléotides U et N (entre U696 et G697), l’empilement des nucléotides qui se trouvent en 3' du U (G697-A698-C699) et la présence d’un pont hydrogène entre le groupement 2'-OH du U et le N7 du nucléotide R (U696 2'-OH-A698 N7) [113] (Figure 1.9). Cependant, deux des caractéristiques importantes définissant un U-turn canonique sont manquantes : l’empilement de la base du U sur le groupement 5'-phosphate du nucléotide R (U696 et A698) et un pont hydrogène entre le proton imino du U et le groupement 3'-phosphate du nucléotide R (U696 H3-A698 3'-phosphate) [113]. Avec l’ajout d’ions magnésium, la boucle V adopte une structure globalement plus compacte avec un motif de type U-turn composé de toutes les caractéristiques principales du U-turn canonique [114]. En effet, cet arrangement plus compact est associé à un changement de direction du squelette ribose- phosphate plus drastique favorisant l’empilement de la base U696 sur le groupement 5'- phosphate du A698 et la formation du pont hydrogène manquant entre U696 H3-A698 3'-phosphate [114] (Figure 1.9). Globalement, ce motif U-turn permet aux nucléotides G697, A698 et C699 d’exposer leur face W-C dans le sillon mineur, créant une configuration idéale pour interagir avec la boucle terminale du substrat [114]. De plus, il a été démontré que les trois bases formant l’interaction kissing-loop adoptent une structure similaire à celle d’un brin d’hélice de forme A. De cette façon, elles se retrouvent dans une conformation compatible avec la formation de paires de bases [114].

Figure 1.9 : Effet du magnésium sur la structure de la boucle terminale du domaine V (A)

Séquence et structure secondaire de la tige-boucle V utilisées pour les deux études RMN [113, 114]. (B) Superposition des structures tridimensionnelles de la boucle V en absence (couleurs pâles) et en présence de magnésium (couleurs foncées). Les lignes pointillées représentent les ponts hydrogènes retrouvés dans la boucle V (U696 H3-A698 3'-phosphate et U696 2'-OH-A698 N7). Le code de couleur utilisé en (B) correspond à celui utilisé en (A).

La présence d’ions magnésium est associée à un autre changement important dans la structure de la boucle V : la position du nucléotide U700. En absence de magnésium, la base du nucléotide U700 est exclue de la boucle et exposée dans le sillon majeur où elle est empilée sur le groupement 5'-phosphate du C699 [113]. Le ribose du U700, quant à lui, se retrouve entre ceux des nucléotides C699 et A701 [114] (Figure 1.9). Avec l’ajout d’ions magnésium, la base et le ribose du U700 subissent un changement considérable de position pour se retrouver tout deux complètement exclus de la boucle du côté du sillon mineur [114] (Figure 1.9). Ce mouvement amène le U700 près des nucléotides G697, A698 et C699 impliqués dans l’interaction kissing-loop (Figure 1.9), suggérant qu’il pourrait lui aussi contribuer à la reconnaissance du substrat [114].

En résumé, ces deux études RMN démontrent clairement que la conformation libre de la boucle V prédispose plusieurs nucléotides dans le sillon mineur (G697, A698, C699 et U700), facilitant leur accessibilité pour l’interaction avec la boucle I du substrat. Toutefois, des études structurales supplémentaires sont nécessaires pour connaître les déterminants structuraux qui définissent précisément l’interface de l’interaction et la reconnaissance du substrat.

Domaine I

Le substrat naturel du ribozyme adopte soit une conformation unshifted inactive ou shifted active et toutes deux ont été étudiées par spectroscopie RMN. Tout d’abord, deux études de RMN ont été réalisées sur la conformation inactive du substrat. La première étude a été effectuée sur une tige-boucle dans laquelle la tige Ib et la boucle terminale ont été remplacées par une tige plus courte de trois paires de bases terminée par une boucle terminale stabilisatrice de quatre nucléotides [110], puis la deuxième étude a été réalisée sur le substrat naturel complet [111]. Quelques années plus tard, une troisième étude par RMN a été publiée sur la conformation active du substrat. Cette étude a été effectuée sur une tige-boucle dans laquelle seulement la boucle interne dans sa conformation active ainsi que les paires de bases adjacentes du ribozyme ont été préservées (G618 à G623 et C637 à C641) [112]. En effet, à des fins de simplification, la tige Ib a été raccourcie, puis la boucle terminale a été remplacée par une boucle terminale composée de quatre nucléotides [112].

Les deux études RMN de la conformation inactive du substrat ont démontré que la boucle interne est formée de trois paires de bases non canoniques: G620-A639, A621- G638 et A+622-C637 [110, 111] (Figure 1.10). De plus, la deuxième étude, effectuée sur le substrat complet, a montré que la tige Ib est caractérisée par quatre paires de bases W-C G-C: G623-C636, G624-C635, G625-C634 et C626-G633 [90, 111]. Bien qu’une cinquième paire de bases (G627-C632) ait initialement été proposée par des études biochimiques [90], celle-ci n’a pas été confirmée par les études RMN du substrat complet [111]. Cette étude par RMN a aussi permis de constater que la boucle terminale

du substrat est composée de six nucléotides, dont l’organisation est dynamique et désordonnée [111].

Figure 1.10 : Comparaison des conformations inactive et active de la boucle interne du substrat. (A) Séquences et structures secondaires de la boucle interne du substrat démontrant les

différentes paires de bases (représentées par des traits noirs) de chaque conformation. (B) Superposition des structures de la boucle interne du substrat en conformation inactive (couleurs pâles) [110] et active (couleurs foncées) [112]. Le code de couleur utilisé en (A) correspond à celui utilisé en (B). (Adapté de [112]).

L’étude RMN de la conformation active du substrat a montré que la boucle interne du substrat forme un réseau de paires de bases différent de celui observé dans sa conformation inactive. En effet, les cinq nucléotides de la boucle interne sont organisés en trois paires de bases G-A où le G638 participe à deux de ces paires, avec le A621 et le A622. La troisième paire de base G-A se forme entre le G620 et le A639 et est similaire à celle observée dans la boucle interne inactive (Figure 1.10). De plus, ces paires de base G-A sont impliquées dans un motif de liaison au magnésium de type 5'-A R-3' / 5'-Y G-3' où R=adénine ou guanine et Y=cytosine ou uridine. En effet, deux sites de liaisons ont été identifiés à chaque extrémité de la boucle interne: 5'-A639 G640-3' / 5'-C619 G620-3' et 5'-A622 G632-3' / 5'-C637 G638-3'. Le premier site est commun aux conformations inactive et active du substrat, tandis que le dernier site est exclusif à la

conformation active [112]. Cette étude par RMN a aussi démontré que la boucle interne active du substrat, composée de ses trois paires de bases G-A flanquées de chaque côté par une paire de base G-C, constituent un motif d’interaction tertiaire [112]. Ce motif a d’ailleurs été identifié dans d’autres ARN, dont l’ARNr 16S où il participe à une interaction tertiaire de type ribose zipper. Ce type de motif permet à deux brins d’ARN d’interagir grâce à l’établissement d’un réseau de ponts hydrogènes entre les groupements 2'-OH des riboses de chacun des brins. De ce fait, il a été proposé que ce même motif dans la boucle active du substrat pourrait aussi participer à une interaction tertiaire avec le domaine catalytique pour la formation du site actif du ribozyme [112].

Dans l’ensemble, les structures à haute résolution des domaines I et V ont permis de caractériser plusieurs éléments de structure importants de leur forme libre. En effet, la boucle terminale V seule est structurée et prédispose ses nucléotides pour former l’interaction kissing-loop avec le substrat. Toutefois, le substrat présente une boucle terminale qui est plutôt désordonnée, mais à l’opposé, une boucle interne structurée. Les caractéristiques uniques de la configuration active de cette boucle interne comprennent un site supplémentaire de liaison au magnésium et l’adoption d’un motif de structure tertiaire probablement impliqué dans son positionnement au sein du ribozyme.

Enfin, bien que les études biochimiques précédentes semblent indiquer que l’interaction entre les domaines I et V soit définie par la formation de trois paires de bases W-C, d’autres déterminants structuraux sont possiblement impliqués dans cette interaction pour permettre au ribozyme de reconnaître spécifiquement son substrat. Effectivement, les études biochimiques précédentes ont montré que les nucléotides C629 et A701 jouent probablement un rôle dans l’interaction kissing-loop [82]. Une structure à haute résolution de l’interaction kissing-loop I/V est définitivement nécessaire pour mieux comprendre les éléments qui déterminent la reconnaissance du substrat et son activation.