Le domaine catalytique 27

Le domaine catalytique (domaines hélicoïdaux II-VI) est organisé par deux jonctions à trois voies : la jonction II-III-VI, qui joint les domaines hélicoïdaux II, III et VI formant le sous-domaine II-III-VI et la jonction III-IV-V qui connecte les domaines hélicoïdaux III, IV et V formant le sous-domaine III-IV-V (Figure 1.11 A). Ces jonctions permettent d’orienter les domaines hélicoïdaux du domaine catalytique et de créer une niche pour accueillir le substrat. De plus, chacun des sous-domaines du domaine catalytique démontre un rôle distinct, soit dans l’optimisation de liaison du substrat (sous-domaine III-IV-V) ou dans la création du site actif pour permettre la réaction catalytique (sous-domaine II-III-VI).

Figure 1.11 : Représentation du domaine catalytique du ribozyme VS et de ses éléments structuraux importants. (A) Séquence et structure secondaire du domaine catalytique. Les

deux jonctions sont encadrées. (B) Représentation schématique du domaine catalytique. Les éléments en noir sont essentiels, alors que ceux en gris ne le sont pas. Les «X» indiquent que la position du nucléotide est importante, mais pas l’identité de la base. Les deux jonctions, ainsi que la boucle A730 contiennent des nucléotides importants représentés par un symbole dont la taille est proportionnelle à leur importance. [93, 116]

De substantielles études de mutagénèse ont montré que les domaines hélicoïdaux du domaine catalytique du ribozyme ne présentent pas tous la même importance fonctionnelle. Ceci a été mis en évidence par la variation du niveau de tolérance du ribozyme aux modifications de séquence. En effet, la quasi-totalité de la tige IV et la partie distale des domaines II et VI (IIa et VIc, Figure 1.11) peuvent être tronquées sans affecter significativement l’activité du ribozyme [88, 89, 93 , 104 ] (Figure 1.11 B). Par

contre, bien que la grande majorité de la séquence des tiges III et V puisse être modifiée, le nombre de paires de bases qu’elles contiennent est crucial pour l’activité du ribozyme [89, 117 , 118] (Figure 1.11 B).

Bien que certains éléments du domaine catalytique puissent être modifiés ou éliminés, d’autres sont plutôt cruciaux pour son repliement et pour l’activité catalytique du ribozyme. C’est le cas des adénines non appariées (bulge) interrompant les domaines II, III et VI, dont l’identité peut être modifiée (A652, A718, A725, A726, Figure 1.11). Par contre, leur présence ainsi que leur position sur la tige sont importantes [90, 93, 95, 117, 119]. D’un autre côté, la modification et la délétion des nucléotides non appariées situés dans les jonctions II-III-VI et III-IV-V diminuent grandement l’activité du ribozyme et interférent avec le repliement des jonctions [117, 120 , 121] (Figure 1.11). Deux autres éléments du domaine catalytique semblent être cruciaux pour le fonctionnement optimal du ribozyme : la boucle interne A730 du domaine VI et la boucle terminale du domaine V, toutes deux impliquées dans des interactions avec le substrat [82, 89, 93, 97, 107 ] (Figure 1.11). La mutation ou la délétion individuelle de la majorité des nucléotides de ces éléments entraîne une diminution drastique d’activité [82 , 93, 94, 122].

Davantage de modifications ont été effectuées dans le domaine catalytique dans le but de mieux comprendre l’importance et l’implication de chacun de ses sous- domaines II-III-VI et III-IV-V. D’une part, au niveau du sous-domaine II-III-VI, la jonction II-III-VI peut être remplacée par une autre jonction retrouvée dans l’ARNr 23S et le ribozyme demeure actif, mais montre une baisse d’activité de clivage de dix fois [120]. Lorsque la boucle interne A730 est enlevée et remplacée par une simple paire de bases W-C A-U, l’activité du ribozyme est perdue [95]. D’un autre côté, certaines séquences de boucles internes non naturelles peuvent remplacer la boucle A730 et sont compatibles avec l’activité de clivage du ribozyme. Cette activité est toutefois beaucoup plus lente qu’en présence de la séquence naturelle [95]. D’autre part, au niveau du sous- domaine III-IV-V, il a été démontré que la jonction à trois voies III-IV-V peut être remplacée par une jonction à quatre voies [121]. En effet, la région située entre les

domaines III et V, dans laquelle un motif de type U-turn a été prédit basé sur la séquence (U710-G711-A712), peut être entièrement remplacée par une structure en tige- boucle, créant ainsi une jonction à quatre voies [121]. Aussi, il a été démontré qu’en absence du sous-domaine III-IV-V en entier, le ribozyme demeure fonctionnel, bien qu’il soit beaucoup moins efficace que le ribozyme entier [95]. Ces différents résultats indiquent que les éléments essentiels à la formation du site actif du ribozyme sont situés dans le sous-domaine II-III-VI et dans le substrat [95]. De plus, malgré le fait que le sous-domaine III-IV-V ne soit pas essentiel pour la réaction catalytique, il contribue significativement au fonctionnement optimal du ribozyme. En effet, le sous-domaine III- IV-V favorise la formation de l’interaction kissing-loop entre les domaines I et V, ce qui permet l’activation du substrat et en facilite le positionnement dans le sous-domaine II- III-VI [89, 95, 109, 119, 121].

En terminant, les études sur le domaine catalytique du ribozyme VS ont permis de mettre en évidence le rôle distinct de chacun des deux sous-domaines : le rôle catalytique du sous-domaine II-III-VI, particulièrement de sa boucle A730 et le rôle structural de liaison et d’activation du substrat pour le sous-domaine III-IV-V. De plus, bien qu’on puisse lui enlever des domaines ou encore en modifier la séquence, le domaine catalytique naturel du ribozyme VS contribue considérablement à l’efficacité de son fonctionnement. Ses deux jonctions naturelles guident l’orientation de chacun de ses domaines hélicoïdaux et facilitent la formation des interactions tertiaires nécessaires au positionnement du substrat et à la création de son site actif.