Les difficultés de la spectroscopie RMN 55

Tel que mentionné plus haut, la spectroscopie RMN est une méthode idéale pour faire l’étude de la structure des ARN, mais celle-ci est également associée à quelques difficultés qui augmentent avec la taille des ARN. Une première difficulté est la dispersion restreinte des valeurs de déplacements chimiques des protons des quatre nucléotides qui composent l’ARN (Figure 1.24). Ceci constitue un problème particulièrement important pour l’attribution des signaux, car cette faible dispersion crée beaucoup de superposition de signaux et d’ambigüités (Figure 1.24 C). Puis, une deuxième difficulté concerne l’obtention de contraintes de distances et d’angles qui sont locales, plutôt que globales. En effet, l’effet NOE et le couplage J s’observent sur une distance limitée, notamment ~ 5Å pour l’effet NOE, ce qui permet de définir des environnements locaux. Ceci compromet la précision de la structure globale, car l’effet

NOE et le couplage J ne se mesurent pas sur une longue distance ou à travers des

domaines éloignés. La rencontre de ces difficultés a eu comme avantage de stimuler l’avancement du domaine de la RMN et a permis à la méthode d’évoluer en développant différentes approches pour résoudre ou réduire ces difficultés.

Figure 1.24 : Composition chimique de l’ARN et caractéristiques spectrales des différents protons de l’ARN. Chaque nucléotide est composé (A) d’une partie ribose-phosphate et (B)

d’une base azotée. (C) Spectre 1H 1D du proton d’un ARN de 14 nt contenant une boucle UUCG. Les différents protons sont attribués sur le spectre selon la même numérotation que celle utilisée en (A) et (B). (Adapté de [226]).

Dispersion limitée des déplacements chimiques des protons

La dispersion restreinte des valeurs de déplacement chimique des protons des nucléotides A, C, G et U crée des problèmes de superposition de signaux. En effet, ces nucléotides sont tous composés du même ribose et les bases azotées ont toutes le même anneau purine ou pyrimidine comme fondation (Figure 1.24 A, B). Néanmoins, les déplacements chimiques des hydrogènes des bases présentent un peu plus de dispersion grâce aux différents groupements fonctionnels qui différencient chaque pyrimidine et purine (Figure 1.24 C). Outre la nature chimique des nucléotides, un autre élément qui influence les déplacements chimiques des protons est l’environnement chimique et

électronique dans lequel ils sont situés. Puisque l’ARN est en grande partie composé d’éléments hélicoïdaux, de nombreux nucléotides se retrouvent dans un environnement relativement similaire, générant ainsi des déplacements chimiques semblables et par conséquent de la superposition de signaux. Le problème de dispersion peut être réduit significativement en passant de la RMN homonucléaire, qui se limite à l’analyse d’un seul noyau, le proton, à l’utilisation de la RMN hétéronucléaire dans laquelle plusieurs noyaux sont utilisés, le carbone, l’azote et le proton. La RMN hétéronucléaire nécessite le marquage isotopique des atomes de carbones et d’azotes avec les isotopes 13_{C et} 15_N

pour que ceux-ci deviennent détectables par RMN. De cette façon, il est possible d’enregistrer des expériences plus complexes avec des dimensions additionnelles (2D ou 3D, Figure 1.25) pour faire la détection des corrélations H-C ou H-N.

Figure 1.25 : Représentation schématique de spectres RMN à une ou plusieurs dimensions.

Le spectre à une dimension (1D) montre tous les signaux selon une seule dimension. L’ajout d’une dimension (2D) permet une dispersion de signaux selon la deuxième dimension. Un spectre en trois dimensions (3D) est un assemblage de spectres en 2D dispersés selon une troisième dimension. (Tiré de [227]).

Avec la RMN hétéronucléaire, il devient possible d’observer les signaux des protons via le carbone ou l’azote auquel ils sont liés. L’avantage de corréler les signaux 1H à ceux du carbone ou de l’azote est leur grande dispersion de signal, ce qui permet de mieux résoudre les signaux 1H. Ces corrélations permettent aussi d’utiliser la fréquence hétéronucléaire pour faire l’attribution des signaux. Par exemple, les H3 des uridines et les H1 des guanines présentent le même intervalle de déplacement chimique, de 9 à 15 ppm, mais il est possible de les distinguer par le déplacement chimique de leur azote, de 157 à 162 ppm pour le N3 des uridines et de 145 à 148 ppm pour le N1 des guanines [222] (Figure 1.26 C). L’attribution des protons est ainsi grandement facilitée.

Figure 1.26 : Dispersion spectrale des différents atomes de carbone et d’azote qui composent l’ARN. Déplacements chimiques des carbones des (A) bases azotées et du (B)

ribose. (C) Déplacement chimiques des atomes d’azotes des quatre types de bases. (Données tirées de [222]).

Ce type de marquage est idéal pour des ARN d’une cinquantaine de nucléotides. Cependant pour faire l’étude d’ARN de plus de grande taille, d’autres stratégies peuvent être utilisées : le marquage sélectif ou par fragment et l’approche du divide and conquer. La stratégie de marquage isotopique sélectif permet la détection d’un seul type de nucléotide ou d’une combinaison de nucléotides, par exemple seulement les cytosines ou seulement les cytosines et les guanines sont marquées avec les isotopes 13C/15N, alors que les autres nucléotides demeurent non marqués. Il est aussi possible d’utiliser plusieurs types d’échantillons dans lesquels seulement un des domaines de la molécule est marqué avec des nucléotides 13C/15N. La stratégie du divide and conquer consiste à diviser la molécule entière en différents fragments qui seront par la suite caractérisés de façon individuelle et isolée du contexte naturel de la molécule entière. Cette approche nécessite toutefois de la prudence, car la structure des différents fragments isolés peut varier de celle des fragments dans le contexte de la molécule entière. Il est néanmoins possible d’utiliser cette approche en s’assurant que le repliement de chaque fragment est similaire à celui retrouvé dans la molécule entière. Le but ultime est d’utiliser les structures à haute résolution des fragments isolés et une structure à basse résolution de la molécule entière pour reconstruire un modèle RMN à haute résolution [223].

Contraintes de distances locales

Une autre difficulté de la RMN dans la détermination de structure provient du fait que l’information extraite des données NOE et du couplage J est généralement locale. Dans l’étude de molécules de petite taille, comme celles contenant uniquement une courte tige-boucle, le manque de données à longue distance n’est pas aussi important que pour un complexe de plusieurs ARN ou encore pour un ARN composé de plusieurs domaines. Dans de tels contextes, des données à longue distance deviennent nécessaires pour déterminer une structure globale précise. Ce type de données peut être obtenu par spectroscopie RMN grâce au phénomène de couplage dipolaire résiduel (residual dipolar coupling, RDC). Le couplage dipolaire est une interaction à travers l’espace qui survient entre deux noyaux, par exemple N-H ou C-H [228]. Toutefois, lorsque les molécules bougent de façon aléatoire, tel qu’observé en solution, ce phénomène de couplage dipolaire avoisine 0. À l’opposé, lorsque les molécules sont orientées, tel qu’observé à l’état solide, il est possible de mesurer un fort couplage dipolaire. Dans le but de mesurer un couplage dipolaire en solution, il suffit de créer un environnement dans lequel les molécules sont partiellement orientées dans le champ magnétique en ajoutant un agent responsable de créer cet arrangement, par exemple des bicelles ou des phages filamenteux [228]. Chacun des couplages mesurés dans les liaisons N-H ou C-H représente un vecteur, puis l’analyse et le traitement des données de RDC permettent de connaître l’orientation de chaque vecteur par rapport à un référentiel global (Figure 1.27). De cette façon les RDC permettent d’obtenir de l’information sur l’orientation des différents domaines de la molécule et en combinaison avec les données provenant des signaux NOE, ils permettent d’améliorer la précision de la structure globale.

Figure 1.27 : Couplage dipolaire résiduel (RDC). (A) Représentation schématique de

l’alignement partiel d’un ARN en présence d’un agent d’alignement, tel que le phage Pf1 en présence d’un champ magnétique B0. (B) Mesure des couplages dipolaires résiduels à partir de la séparation des résonances observée en présence (J+D) et en absence (J) d’un agent d’alignement. D représente le RDC et J le couplage scalaire J (Adapté de [229]).