Activation du substrat par l’interaction kissing-loop I/V 17

La formation de l’interaction kissing-loop I/V est accompagnée d’un réarrangement de la structure du substrat, ce qui l’active pour la catalyse. Ceci implique que le substrat naturel du ribozyme VS peut adopter deux conformations : inactive et

peut passer d’une conformation unshifted inactive à une conformation shifted active, on réfère à une conformation dite shiftable. Les conformations unshifted et shifted sont toutes deux composées de quatre éléments structuraux : deux tiges (Ia et Ib) séparées par une boucle interne contenant le site de clivage entre les nucléotides G620 et A621, puis une boucle terminale qui ferme la tige Ib (Figure 1.5). De ces quatre éléments de structures, seulement la tige Ia demeure inchangée suite au réarrangement structural.

Les conformations adoptées par le substrat ont été démontrées initialement par des expériences de sélection in vitro (systematic evolution of ligands by exponential

enrichment, SELEX), ainsi que des analyses de covariation et de modifications

chimiques. Différentes séquences de substrat ont été obtenues par un protocole de sélection basé sur la réaction de ligation du ribozyme [107]. L’analyse de ces séquences démontre peu de covariation et moins d’appariement en paire de bases que le modèle initial (Ia et Ib représenté en Figure 1.5). L’analyse de la structure secondaire prédite pour ces séquences met en évidence deux groupes : le premier est caractérisé par des ARN composés des mêmes cinq paires de bases prédites dans le modèle initial (Figure 1.7 A) et le deuxième groupe est composé d’ARN formant une tige Ib différente dans laquelle les nucléotides G623, G624 et G625 sont appariés au C637, C636 et C635 plutôt qu’au C636, C635 et C634 tel qu’observé dans le modèle initial (Figure 1.7 B) [107]. Cette dernière configuration a été appelée shifted, étant donné le déplacement du brin 3' de l’hélice, créant une shifted helix. De plus, dans ces séquences, le nucléotide en position 626 est soit apparié au 634 ou encore non apparié, comparativement au modèle initial où le 626 est plutôt apparié au 633 [107]. L’ensemble de ces expériences a également montré que la conformation du deuxième groupe, contenant la shifted helix, est active et que la conformation du premier groupe, similaire à celle initialement prédite, est aussi active mais seulement parce qu’elle peut subir un changement de conformation lui permettant d’adopter la shifted helix. Par conséquent, cette conformation a été appelée shiftable. Le changement de conformation a été démontré par des expériences de modifications chimiques dans lesquelles différents agents chimiques ont été utilisés pour sonder l’accessibilité au solvant des nucléotides composant le substrat. En effet, le patron de protection chimique de la tige Ib de la conformation du

premier groupe change entre les conditions avec magnésium seulement et avec magnésium en plus du ribozyme, alors que celui de la conformation contenant la shifted

helix, demeure inchangé [107]. En plus, il a été démontré que des substrats modifiés

bloqués dans une conformation inactive (unshifted) ne permettent pas l’activité du ribozyme, alors que des substrats modifiés bloqués dans une conformation active (shifted) ou encore pouvant passer de la conformation inactive à active (shiftable) sont compatibles avec son activité [107]. La suite de la section décrira chacune des deux conformations (shiftable et shifted) du substrat, ainsi que le changement de conformation permettant l’adoption de la conformation shifted contenant la shifted helix.

Figure 1.7 : Séquences et structures secondaires des deux groupes représentant le substrat du ribozyme VS. (A) Séquence représentant la conformation naturelle shiftable du substrat, telle

qu’observée dans le modèle initial. (B) Séquence représentant la conformation shifted du substrat. Les guanines encadrées dans les conformations shiftable et shifted forment des paires de bases avec des cytosines différentes (cytosines encerclées) (Adapté de [107]).

Avant d’adopter la shifted helix, le substrat naturel shiftable est caractérisé par une conformation unshifted inactive, qui a été caractérisée par des expériences de mutagénèse et de modifications chimiques. Celle-ci est composée d’une boucle interne symétrique de six nucléotides comprenant les G620, A621, A622, C637, G638 et A639 [90] (Figure 1.8). De son côté, la tige Ib est caractérisée par cinq paires de bases W-C G- C impliquant les G623 à G627 avec les C636 à C632 respectivement [90]. Puis, la

boucle terminale est formée par quatre nucléotides : U628, C629, G630 et U631 [90] (Figure 1.8).

Figure 1.8 : Réarrangement de la structure du substrat. Le réarrangement du substrat d’une

conformation unshifted à shifted est caractérisé par un helix shift dans lequel le brin 3' est déplacé en direction 5'. La conformation shifted résultante comprend une shifted helix dans laquelle les G623, G624 et G625 sont appariés aux C637, C636 et C635 respectivement. La cytosine 634 se retrouve non appariée et la boucle interne contenant le site de clivage (tête de flèche) passe d’une conformation initiale de six nucléotides à une conformation à cinq nucléotides. (Adapté de [107]).

Lors de la liaison du domaine V en présence d’ions magnésium, la conformation du substrat passe à une conformation shifted active qui a également été caractérisée par des expériences de mutagénèse et de modifications chimiques [107, 109]. Ce réarrangement comprend deux changements majeurs : un glissement des paires de bases de la tige Ib appelé helix shift et un réarrangement de la boucle interne [107, 109] (Figure 1.8). Premièrement, lors du helix shift les guanines 623, 624 et 625, initialement appariées aux cytosines 636, 635 et 634, subissent un changement de partenaire pour se retrouver appariées aux cytosines 637, 636 et 635, formant la shifted helix (Figure 1.8). Ceci crée un effet de glissement du brin 3' de la tige Ib en direction 5' qui s’accompagne de l’expulsion de la cytosine 634 de la tige [107, 109]. Deuxièmement, lors de la réorganisation de la boucle interne, le C637 quitte celle-ci en glissant en direction 5'

pour former une paire de base avec le G623 dans la tige Ib [107, 109]. Conséquemment, la boucle interne passe d’une conformation initialement symétrique de six nucléotides à une conformation asymétrique de cinq nucléotides (Figure 1.8). Ces changements ont été démontrés notamment par les patrons de protection chimique des nucléotides C634 et C637. Dans le contexte de la conformation unshifted, le C634 est protégé des modifications chimiques, tandis que le C637 est accessible. Ceci suggère que le C634, contrairement au C637, fait partie d’un empilement ou encore participe à une paire de bases [90, 107]. Dans le contexte de la conformation shifted, des patrons de protection chimique inverses sont observés pour ces deux cytosines, suggérant que le C637, contrairement au C634, fait partie d’un empilement ou encore participe à une paire de bases [90, 107]. Enfin, ce réarrangement comprend aussi un changement au niveau de la dernière paire de base de la tige Ib, entre le G627 et le C632. Lorsque le substrat est dans la conformation shifted, le C632 change de partenaire, délaissant le G627 de la tige Ib, pour s’apparier au G697 de la boucle V. Celui-ci participe donc directement à la formation de l’interaction kissing-loop I/V [82].

Le réarrangement du substrat est essentiel pour l’activité du ribozyme et la conformation shifted facilite sa liaison au ribozyme. Ceci a aussi été démontré par des études de liaison permettant de mesurer l’affinité de liaison avec des substrats adoptant différentes conformations [115].