Mécanisme catalytique 30

La réaction catalysée par le ribozyme VS est un auto-clivage réversible qui s’effectue par un mécanisme de transestérification entre les nucléotides G620 et A621 (Figure 1.13). Le ribozyme VS, ainsi que les autres membres de la classe des ribozymes nucléolytiques auto-clivants effectuent le clivage d’un lien phosphodiester par l’attaque

d’un groupement 2'-OH sur le groupement phosphate adjacent en 3' par un mécanisme de substitution nucléophile bimoléculaire (SN2) [91, 99, 102, 123] (Figure 1.13). Pour ce

faire, les nucléotides impliqués dans la réaction doivent tout d’abord être alignés avec le lien à cliver pour favoriser l’attaque nucléophile. Le groupement 2'-OH du ribose impliqué doit être déprotoné pour permettre son activation et agir en tant que groupement nucléophile (Figure 1.13). Puis, l’attaque de ce nucléophile sur le groupement phosphate en 3' est suivie d’une inversion de configuration de celui-ci et de la création d’un intermédiaire réactionnel de type trigonal bipyramidal (Figure 1.13). Enfin, la réaction se complète par le transfert d’un proton au groupe partant, le 5'-O, entrainant la rupture du lien 5'-O-P et la formation de deux produits de clivage dont un présentant une extrémité 2'-3' cyclique phosphate et l’autre une extrémité 5'-OH (Figure 1.13). Il a été proposé que des nucléotides du ribozyme participent activement à cette réaction comme accepteur du proton 2'-OH et donneur de proton pour former le 5'-OH dans une catalyse de type acide-base générale [99].

Figure 1.13 : Mécanisme catalytique de type acide-base générale. Les éléments de la réaction

de clivage sont représentés en rouge alors que ceux de la réaction de ligation sont représentés en bleu. La réaction de clivage est catalysée par une base générale (X) et un acide général (Y-H+_). Dans la réaction inverse de ligation, le X-H+ et le Y joueront les rôles d’acide et de base général respectivement. L’intermédiaire réactionnel trigonal bipyramidal est encadré de crochets. (Adapté de [124]).

Suite à une vaste exploration biochimique du ribozyme VS, notamment par des études de mutagénèse et l’utilisation d’interférence par des nucléotides analogues (nucleotide analogue interference mapping, NAIM), il a été possible de déterminer les nucléotides impliqués dans la catalyse par le ribozyme VS, ainsi que leurs groupements fonctionnels. Deux nucléotides ont ainsi été identifiés, soient le A756 dans la boucle A730 [93, 94, 96-98, 125] et le G638 dans la boucle interne contenant le site de clivage [99]. Leur mutation individuelle cause une diminution d’activité de 1000 à 10 000 fois sans toutefois affecter ni le repliement du ribozyme ni la liaison du substrat. Les études de mutagénèse et de NAIM ont aussi permis de déterminer que ce sont les faces W-C de ces nucléotides qui sont importantes pour la catalyse, le N1 pour le A756 et les groupements carbonyles en C6 et imino en N1 pour le G638. L’implication de chacun de ces nucléotides a également été démontrée par des expériences de complémentation effectuées avec un mélange de deux types de ribozymes dont l’un contenant une mutation du A756 (A756C) et l’autre une mutation de G638 (G638A) [126]. L’auto- clivage de chaque ribozyme mutant individuel est fortement diminué, alors que le mélange des deux types de ribozyme démontre un bon taux de clivage, indiquant que le substrat intact de l’un peut interagir avec le domaine catalytique intact de l’autre recréant un site actif fonctionnel en trans [126]. L’ensemble de ces résultats met en évidence l’implication des nucléotides A756 et G638 dans la catalyse du clivage par le ribozyme VS.

Le rôle des bases A756 et G638 dans la catalyse acide-base générale du ribozyme VS a été précisé par des études substantielles de NAIM et des mesures du taux de clivage du ribozyme en fonction du pH, appelées profils de dépendance au pH. Tout d’abord, pour que les bases A756 et G638 puissent participer à la catalyse comme accepteur et donneur de protons, les pKa de leurs groupements fonctionnels doivent se retrouver sous

leur forme protonée et déprotonée respectivement. Puisque les pKa des N1 des

guanosines et adénosines sont de 9.4 et 3.5 respectivement [127], les formes actives protonées des bases A et déprotonées des bases G sont peu représentées à pH neutre, les rendant peu susceptibles de participer à la catalyse. Les études de NAIM et les profils de dépendance au pH effectués sur le ribozyme ont démontré un profil caractérisé par une courbe en forme de cloche (bell shaped pH profile) correspondant à deux valeurs de pKa

apparent de 5.2 et 8.4 pour un ribozyme en trans [99] et de 5.8 et 8.3 pour un ribozyme en cis [100]. Ces valeurs ont été associées aux groupements donneur et accepteur de proton des bases G638 et A756 [97, 99, 125]. Ces résultats sont en accord avec une catalyse de type acide-base générale, toutefois ils ne permettent pas de discriminer quels nucléotides jouent les rôles de base et d’acide. Ceci a toutefois été résolu en substituant le lien phosphate 5'-P-O à cliver par un lien phosphorothioate 5'-P-S [102]. L’insertion d’un atome de soufre crée un meilleur groupe partant qui ne nécessite pas de protonation pour compléter la réaction de clivage. Cette substitution a permis de rétablir complètement l’activité de clivage d’un ribozyme portant la mutation A756G dont la catalyse est normalement fortement diminuée, suggérant un rôle d’acide général pour le A756. De plus, le profil de dépendance au pH d’un ribozyme contenant la substitution 5'-P-S est en accord avec le G638 agissant comme base générale dans le mécanisme acide-base générale [102]. Ainsi, tous ces résultats indiquent que le ribozyme VS catalyse le clivage de son substrat par une catalyse de type acide-base générale dans laquelle le G638 agit comme base en déprotonant le groupement 2'-OH du ribose G620, puis le A756 agit comme acide en cédant un proton au groupe partant 5'-OH, complétant la réaction de clivage (Figure 1.14) [102].

Figure 1.14 : Mécanisme proposé utilisé par le ribozyme VS pour catalyser la réaction de clivage. Le G638 et le A756 jouent les rôles de base et d’acide général respectivement. Les

lignes pointillées représentent les liaisons qui seront formées ou défaites dans le clivage. (Adapté de [102]).