La spectroscopie de dichro¨ısme circulaire en UV lointain (spectre de 180 nm `
a 250 nm) renseigne sur la structure secondaire de la prot´eine ´etudi´ee (partie Mat´eriel et M´ethodes, chapitre 8). En particulier, le signal d’une prot´eine repli´ee majoritairement en h´elices α pr´esente deux minima bien marqu´es `a 208 nm et 222 nm.
Les spectres observ´es pour PscE, PscG, PscF (les 3 prot´eines ayant ´et´e ex- prim´ees et purifi´ees s´epar´ement) ainsi que pour les complexes PscE:PscG (suite au m´elange des 2 prot´eines dans un rapport 1:1) et PscE:PscF:PscG (les 3 prot´eines ayant ´et´e co-exprim´ees et co-purifi´ees) pr´esentent tous ces deux minima, ce qui confirme la pr´esence d’h´elices α dans leur structure secondaire, conform´ement aux pr´edictions du programme PSIPred (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/).
La d´enaturation thermique est suivie `a 222 nm afin d’avoir un maximum de signal, entre 4°C et 96°C.
Les spectres ainsi obtenus pour PscE, PscG, PscE:PscG et PscE:PscF:PscG pr´esentent tous une transition thermique coop´erative et sigmo¨ıdale, ce qui rend cette transition compatible avec un mod`ele de repliement `a 2 ´etats. Dans un
tel mod`ele, le repliement est consid´er´e comme une r´eaction chimique entre un ´etat compl`etement d´epli´e et ´etat compl`etement repli´e, sans passage par un in- term´ediaire r´eactionnel. De plus, un tel repliement se fait de mani`ere autonome, sans l’intervention de prot´eines ext´erieures.
Les complexes binaires et ternaires ont des temp´eratures de fusion ´elev´ees, de 62°C et 64°C respectivement.
Les partenaires PscE et PscG s´epar´es ont eux des temp´eratures de fusion plus basses, de 53°C et 52°C respectivement. De plus, la transition thermique est dans ce cas plus lente puisqu’elle se fait sur plus de 50°C.
Cela montre que les partenaires PscE et PscG seuls sont moins stables que le complexe PscE:PscG, ce dernier ´etant un peu moins stable que le complexe ternaire PscE:PscF:PscG. Les trois prot´eines se co-stabilisent donc `a l’int´erieur du complexe.
PscF quand `a lui, surexprim´e seul et donc polym´eris´e en de longues fibres, est tr`es stable puisqu’il ne subit pas de transition thermique. La forme polym´eris´ee est ainsi la forme la plus stable pour PscF, ce qui explique qu’elle polym´erise spon- tan´ement et que ses partenaires PscE et PscG soient n´ecessaires pour bloquer la polym´erisation pr´ematur´ee de PscF, ´energ´etiquement favorable mais fonctionnel- lement d´efavorable.
De plus, les courbes de transition thermique sont toutes r´eversibles et les spectres de dichro¨ısme circulaire avant et apr`es d´enaturation/renaturation sont superposables. Cela montre que non seulement les prot´eines sont capables de se replier de fa¸con autonome apr`es avoir ´et´e d´epli´ees, mais ´egalement que sans agent ext´erieur, les complexes binaires et ternaires se reforment.
Cette augmentation de stabilit´e, suite `a la formation des complexes binaires et ternaires est `a mettre en relation avec les diff´erences de solubilit´e observ´ees lors des purifications de ces prot´eines. En effet PscE et PscG purifi´ees seules sont peu solubles (65 mg/mL), le complexe binaire PscE:PscG est moyennement so- luble (∼20mg/mL), alors que le complexe ternaire PscE:PscF:PscG est tr`es soluble (>100 mg/mL). Les trois prot´eines du complexe participent donc `a la solubilit´e et `a la stabilit´e du complexe, par exemple en prot´egeant des parties hydrophobes qui pourraient ˆetre expos´ees dans le cadre des prot´eines isol´ees et seraient enfouies dans le cadre des complexes binaires et ternaires assembl´es.
R´esultats Complexe ternaire PscE:PscF:PscG : 13.3
Fig. 13.1 –Alignement de s´equences de PscE et PscG chez d’autres bact´eries :
(a) (b)
Fig. 13.2 – Mise en ´evidence de PscE:PscF:PscG et localisation des 3
prot´eines chez P. aeruginosa . (a) Mise en ´evidence de PscE:PscF:PscG par pull- down dans l’extrait cytoplasmique de P. aeruginosa . La souche CHA d´el´et´ee de pscE ou pscG et compl´ement´ee par un plasmide portant le g`ene codant pour His6-PscE ou His6-
PscG respectivement permet la co-´elution par affinit´e pour le nickel des 3 prot´eines. En contrˆole, pour la souche sauvage, aucune prot´eine n’est retenue par affinit´e.(b) Recherche des 3 prot´eines dans le cytoplasme et dans le surnageant de cultures de P. aeruginosa (souche CHA) dans des conditions inductrices pour le T3SS (d´epl´etion en calcium). PscE et PscG restent cytoplasmiques alors que PscF est s´ecr´et´ee. En effet, alors que les 3 prot´eines sont exprim´ees et stables dans le cytoplasme, seule PscF est d´etect´ee dans le surnageant bact´erien (Quinaud et al., 2005 [Qui2005]).
R´esultats Complexe ternaire PscE:PscF:PscG : 13.3
(a) (b) (c)
Fig. 13.3 – N´ecessit´e de la pr´esence conjointe de PscE, PscF et PscG pour la cytotoxicit´e de P. aeruginosa . (a) Recherche par Western Blot de PscE et PscG dans le lysat soluble de la souche sauvage, de la souche d´el´et´ee en pscE et compl´ement´ee par un plasmide portant pscF ainsi que de la souche d´el´et´ee en pscG et compl´ement´ee par un plasmide portant pscF. Dans le cas o`u pscE est d´el´et´ee on n’observe pas PscG, et r´eciproquement. PscE et PscG se co-stabilisent donc dans le cytoplasme bact´erien. (b) D´etection de PscF dans le lysat soluble et dans le surnageant pour les 3 souches utilis´ees pr´ecedemment. Alors que PscF est exprim´ee et stable dans les 3 cas, sa s´ecr´etion n’est possible qu’en pr´esence de ses 2 partenaires PscE et PscG. (c) Cytotoxicit´e de ces 3 souches envers la lign´ee cellulaire J774 de macrophages. La pr´esence conjointe de PscF et ses 2 partenaires est n´ecessaire pour la cytotoxicit´e de P. aeruginosa. (Quinaud et al., 2005 [Qui2005]).
Fig. 13.4 – D´enaturation thermique de PscE, PscF, PscG, PscE:PscG et PscE:PscF:PscG suivie par spectrom´etrie de dichro¨ısme circulaire. PscE:PscF:PscG (vert) est plus stable que PscE:PscG (bleu), lui-mˆeme plus stable que PscE ou PscG seules (violet et cyan respectivement). La forme polym´eris´ee de PscF (rouge) est la plus stable puisqu’elle ne subit pas de transition thermique.
Chapitre 14
D´etermination de la structure
tridimensionnelle de
PscE:PscF:PscG
Afin de mieux comprendre les rˆoles respectifs des 3 prot´eines du complexe PscE:PscE:PscG, nous avons men´e des ´etudes cristallographiques sur celui-ci. Le complexe entier n’ayant pas permis l’obtention de cristaux diffractant plus fine- ment que 10 ˚A , nous avons d´etermin´e une partie plus stable du complexe, dont nous avons pu r´esoudre la structure par cristallographie. Dans cette section nous d´ecrirons ce cheminement de la forme enti`ere vers la forme tronqu´ee de l’h´et´ero- trim`ere et la r´esolution de sa structure tridimensionnelle.
14.1
Essais de cristallogen`ese sur le complexe
ternaire entier
Le complexe entier PscE:PscF:PscG a permis l’obtention de cristaux qui poussent par diffusion de vapeur en goutte suspendue apr`es 2 semaines `a 20°C et pour une concentration prot´eique de 50 mg/mL (figure 14.1). La solution de puits comporte 30% PEG 400, 0.2 M citrate de sodium, 0.1M Tris-HCl pH 8.5, 4% heptanetriol et les cristaux ne poussent que si le m´elange est r´ealis´e manuellement dans des boˆıtes de cristallisation Hampton. L’addition de l’heptanetriol a permis d’aug- menter le volume des cristaux jusqu’`a 4.103 µm3 environ. Cependant, ces cristaux
particuli`erement fragiles (ils sont compos´es d’un empilement de feuillets) se sont r´ev´el´es ˆetre de mauvaise qualit´e ; ils pr´esentent une faible diffraction (environ 9 ˚A) et n’ont pu ˆetre am´elior´es par aucune des techniques essay´ees (recuit, pontage chimique dans les cristaux ou ass`echement avec le PEG [Her2005]).
Fig. 14.1 – Cristaux de PscE:PscF:PscG dans 30% PEG 400, 0.2M citrate de sodium, 0.1M Tris-HCl pH 8.5, 4% heptanetriol.
Nous avons alors suppos´e qu’une partie du complexe ternaire ´etait flexible, et que cette flexibilit´e gˆenait l’empilement cristallin. Ceci nous a conduit `a d´eterminer une partie plus stable du complexe ternaire en effectuant des tests de prot´eolyse m´enag´ee avec plusieurs prot´eases dans le but de couper les zones flexibles, ceci afin d’obtenir la structure cristallographique d’une partie du complexe ternaire.