7.2.1
Croissance cellulaire et surexpression de la prot´eine
d’int´erˆet
Les prot´eines PscE, PscF et ses mutants, PscG ainsi que les complexes prot´eiques PscE:PscF:PscG et PscE:PscF55−85:PscG ont ´et´e exprim´es et purifi´es selon le pro-
tocole suivant.
Une culture est pr´epar´ee en diluant au 1/30`eme une pr´eculture `a saturation dans le milieu TB (Terrific Broth) suppl´ement´e de 100 µg/mL d’ampicilline (Eu- romedex). Les cellules sont laiss´ees `a 37°C sous agitation (220 rpm) jusqu’`a ce qu’elles atteignent une DO600nm ≈0,8 U.A. L’expression de la prot´eine est alors
induite par l’ajout d’1 mM IPTG (Euromedex).
Apr`es 3 heures d’expression `a 37°C, les cellules sont centrifug´ees `a 5500 g pen- dant 15 minutes, les culots bact´eriens obtenus sont resuspendus `a 4°C dans le tampon de lyse (25 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.2 M NaCl, 2% glyc´erol et 1 tablette d’inhibiteurs de prot´ease sans EDTA ( CompleterEDTA-free, Roche)). Les cel- lules sont alors lys´ees par sonication (2 minutes totales de sonication par pulses de 2 secondes espac´ees de 10 secondes). Le lysat obtenu est centrifug´e 30 minutes `a 39200 g afin de s´eparer les prot´eines solubles du mat´eriel insoluble.
7.2.2
Etapes de purification
Chromatographie d’affinit´e sur colonne Nickel-S´epharose
Le surnageant contenant les prot´eines solubles est alors charg´e sur une co- lonne d’affinit´e Chelating S´epharose (Amersham Pharmacia Biotech) de 1-5 mL pr´ealablement charg´ee en Ni2+ et ´equilibr´ee dans le tampon A (25 mM Tris-HCl pH 7.2, 0.2 M NaCl, 2% glyc´erol, 20 mM imidazole). Dans le cas de la purification des complexes ternaires PscE:PscF:PscG ou PscE:PscF55−85:PscG, le tampon A ne contient pas d’imidazole car le complexe d’int´erˆet est ´elu´e d`es 20 mM d’imidazole. La colonne est ensuite lav´ee avec une solution de (1.5 M KCl, 25 mM Tris-HCl pH 7.2), afin d’´eliminer l’ADN r´esiduel, puis lav´ee avec l’´equivalent de 10 volumes de colonne de tampon A. Les prot´eines sont enfin ´elu´ees par un gradient lin´eaire de 20 `a 500 mM d’imidazole. L’imidazole permet de d´etacher les ´etiquettes histidine
des ions Ni2+ fix´es sur la r´esine par comp´etition avec ces derniers. Les fractions sont ensuite analys´ees par SDS-PAGE.
Chromatographie par exclusion de taille
Les fractions contenant la prot´eine d’int´erˆet sont alors charg´ees sur une colonne d’exclusion Superdex 75 HR 10/30 (Pharmacia Biotech) pr´ealablement ´equilibr´ee dans le tampon (25 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA). Dans le cas de PscE:PscF55−85:PscG, le pH utilis´e pour l’´elution est de 6.8.
Coupure de l’´etiquette hexahistidine
L’´etiquette histidine est clivable grˆace au site de reconnaissance `a la thrombine (LVPRGS) situ´e entre le His6 et la prot´eine d’int´erˆet.
Des tests de coupure `a petite ´echelle sont r´ealis´es au pr´ealable `a temp´erature ambiante afin de d´eterminer les conditions de coupure optimales en terme de rap- port enzyme/prot´eine (1:500 et 1:1000) et de temps d’incubation (30 minutes `a 7 heures). Les ´echantillons provenant des diff´erentes conditions de coupure sont alors analys´es sur gel SDS-Page et la meilleure condition (qui correspond `a une coupure compl`ete) est appliqu´ee `a grande ´echelle sur la prot´eine purifi´ee. Typiquement, dans le cas de PscE ou PscF, l’´etiquette histidine est coup´ee apr`es 45 minutes d’incubation avec un rapport 1:1000. Pour PscE:PscF55−85:PscG, il est n´ecessaire
d’incuber la prot´eine avec la thrombine selon un rapport 1:500 pendant 7 `a 10 heures.
Dans le cas de PscE:PscF:PscG, l’´etiquette histidine n’a pas pu ˆetre cliv´ee. Dans tous les cas, lorsque la coupure est termin´ee, l’enzyme est inhib´ee par l’ajout de 1mM de PMSF (Sigma).
Le produit de la r´eaction est alors analys´e par SDS-PAGE et spectrom´etrie de masse d´enaturante.
L’´echantillon cliv´e est `a nouveau charg´e sur une colonne d’exclusion de taille afin d’enlever les fragments d’´etiquettes histidine r´esiduels. 10 mM DTT sont ad- ditionn´es au tampon afin de r´eduire les cyst´eines libres de PscE et PscG.
La puret´e des fractions est alors analys´ee par SDS-Page et spectrom´etrie de masse.
Chapitre 8
Analyses biophysiques
8.1
S´equen¸cage N-terminal
L’identification de la s´equence d’acides amin´es `a l’extr´emit´e N-terminale des prot´eines ´etudi´ees dans cette th`ese a ´et´e effectu´ee selon le principe de la d´egradation d’Edman, r´ealis´ee sur un s´equenceur en phase gazeuse mod`ele 492 (Applied Bio- systems). C’est un processus cyclique par lequel les acides amin´es sont cliv´es un par un `a partir du N-ter de la prot´eine, et identifi´es par HPLC comme d´eriv´es de phenylthiohydantoine.
Ce s´equen¸cage a ´et´e r´ealis´e au Laboratoire d’Enzymologie Mol´eculaire (LEM) `
a l’IBS par Jean-Pierre Andrieu.
Cette technique permet d’analyser des ´echantillons en solution ou de s´equencer des prot´eines pr´ealablement fix´ees sur une membrane. Nous avons choisi cette derni`ere m´ethode puisque nos ´echantillons contiennent plusieurs prot´eines diff´eren- tes, qui ont de cette mani`ere ´et´e analys´ees s´epar´ement.
Pour cela, 30 µg de prot´eines (complexe ternaire ou produits de la prot´eolyse) sont d’abord s´epar´es par un gel d´enaturant de tricine `a 15% d’acrylamide. Le gel est ensuite lav´e dans 10 mM CAPS pH 11, 10% m´ethanol. La membrane PVDF ProBlott (TM) (Applied Biosystems), pr´ealablement lav´ee dans le m´ethanol, est tremp´ee dans ce mˆeme tampon et d´epos´ee sur le gel d’acrylamide. Les prot´eines sont alors transf´er´ees du gel vers la membrane apr`es application d’une tension de 100 V pendant 1h30 `a l’aide d’un appareil de Western Blot. La membrane est ensuite color´ee par du bleu de Coomassie dans 50% m´ethanol, 1% acide ac´etique
pendant 5 minutes puis d´ecolor´ee dans 50% m´ethanol pendant 2 fois 10 minutes. Les bandes correspondant aux prot´eines sont d´ecoup´ees et soumises au s´equen¸cage N-terminal comme d´ecrit pr´ecedemment.
Ceci a permis d’identifier les trois partenaires du complexe PscE:PscF:PscG et les fragments prot´eolytiques suite `a la prot´eolyse m´enag´ee effectu´ee sur le complexe ternaire.