Les macromol´ecules biologiques poss`edent toutes des carbones asym´etriques, elles sont chirales. Dans la nature les prot´eines sont toutes l´evogyres et cette pro- pri´et´e leur conf`ere une activit´e optique lorsqu’elles interagissent avec de la lumi`ere polaris´ee circulairement [Jan1994].
Fig. 8.1 – Spectres de dicho¨ısme circulaire caract´eristiques de l’organisa- tion en structure secondaire d’une prot´eine. (a) Le spectre correspondant `a un repliement en h´elices α (noir) pr´esente 2 minima `a 208 et 222 nm. (b) Le spectre correspondant `a un repliement en feuillet β (bleu) pr´esente 1 minimum vers 210- 212 nm. (c) Spectre correspondant `a une prot´eine mal repli´ee (vert). Image extraite de www.besley.chem.nottingham.ac.uk/research/research-proteincd..html.
La spectroscopie de dichro¨ısme circulaire permet d’obtenir une information sur la structure secondaire des prot´eines. En effet, des repliements en h´elices α, en
Mat´eriel et M´ethodes Analyses biophysiques : 8.5 feuillets β ou en boucles donnent lieu `a des spectres tr`es diff´erents dans l’UV loin- tain (figure 8.1). Deux minima `a 208 et 222 nm sont en outre caract´eristiques d’une organisation en h´elices α, alors qu’un minimum unique vers 210 nm est la signature des feuillets β. Le spectre observ´e pour une prot´eine est une combinaison lin´eaire de ces diff´erentes composantes selon la proportion de la prot´eine repli´ee en h´elices α, en feuillets β ou en boucles. D`es lors, il est `a noter que le dichro¨ısme circulaire est beaucoup plus sensible `a une organisation en h´elices α ; leur contri- bution est susceptible de masquer des contributions venant d’autres ´el´ements de structure secondaire.
Cette technique permet ´egalement de suivre l’´evolution de la structure secon- daire, lors d’une exp´erience de d´enaturation par exemple, et ainsi de mesurer la stabilit´e de la prot´eine.
Le dichro¨ısme circulaire est un effet de l’activit´e optique qui ne d´epend pas de l’orientation des mol´ecules, la mesure peut donc se faire en solution. De plus, cette technique est rapide et requiert peu d’´echantillon (200 µL `a 0.2 mg/mL). L’´echantillon `a l’int´erieur d’une cuvette en quartz QS (Ellma) est plac´e dans un faisceau de lumi`ere polaris´ee droite et gauche alternativement. Il est alors possible d’observer une diff´erence ∆A entre l’amplitude des ondes polaris´ees gauches et droites, diffus´ees par l’´echantillon (AG et AD respectivement) :
∆A = AG− AD (8.2)
G´en´eralement, cette diff´erence d’absorbance ∆A est tr`es faible. Elle est de moins de 1% de l’amplitude de l’onde ´electromagn´etique dans l’UV lointain, do- maine de longueur d’onde dans lequel on se place pour ´etudier la structure se- condaire des prot´eines. Les instruments de mesure doivent donc ˆetre extrˆemement pr´ecis, et la pr´eparation des ´echantillons tr`es soigneuse.
En notant l le trajet optique (largeur de la cuve, en cm) et C la concentration de la prot´eine (en mol/L), on peut ´ecrire
∆ = G− D =
∆A
l × C (loi de Beer-Lambert) (8.3)
8.5.2
Acquisition des donn´ees
La prot´eine purifi´ee est dans le tampon 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 M NaCl, 1mM EDTA. Or aux longueurs d’onde utilis´ees (en dessous de 200 nm), l’absor-
bance du Tris est importante, ce qui perturbe l’exp´erience. L’´echantillon est donc pr´ealablement plac´e dans le tampon 25 mM Phosphate de sodium pH 7.2, 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA, `a une concentration d’environ 50 µM. L’´echange de tampon est r´ealis´e sur colonne de filtration sur gel afin d’´eviter toute pr´ecipitation lors d’une dialyse.
La cuvette utilis´ee est en quartz QS (Ellma) ; elle est transparente aux ondes ´electromagn´etiques de longueurs d’ondes utilis´ees (190-250 nm).
Les spectres ont ´et´e acquis sur un spectropolarim`etre JASCO-810 muni d’un contrˆoleur de temp´erature de type Peltier `a 22°C dans une cuvette de trajet optique d’1 mm.
L’ellipticit´e est mesur´ee pour une longueur d’onde incidente comprise entre 250 et 190 nm avec le tampon seul, puis avec la prot´eine. Le spectre caract´eristique de la prot´eine est alors obtenu en soustrayant la composante due au tampon des valeurs exp´erimentales correspondant `a la prot´eine dans son tampon. L’ellipticit´e [Θ], mesur´ee par le spectropolarim`etre, s’´ecrit
[Θ] = 3300×∆ (8.4) L’ellipticit´e molaire r´esiduelle, qui est report´ee sur les courbes de d´enaturation, est alors calcul´ee selon la relation
[Θ]M RW =
[Θ]×100×Mr
c×d×N (8.5) Avec [Θ] : ellipticit´e mesur´ee (en degr´es), Mr : poids mol´eculaire de la prot´eine (en
Daltons), c : concentration de la prot´eine (en mg/mL), d : largeur de la cuve (en cm) et N : nombre de r´esidus par prot´eine. [Θ] et [Θ]M RW sont donc homog`enes `a
des degr´es×cm2×dmol−1.
Toutes les prot´eines ´etudi´ees dans cette th`ese ont un spectre caract´eristique d’un repliement en h´elices α, ce qui a ´et´e confirm´e par la structure cristallogra- phique du complexe ternaire PscE:PscF55−85:PscG.
La stabilit´e thermodynamique a ensuite ´et´e mesur´ee en se pla¸cant `a 222 nm afin d’avoir un maximum de signal, pour des temp´eratures comprises entre 4 et 96°C. La temp´erature de la cuve est ainsi accrue par paliers d’1°C par minute, la valeur de l’ellipticit´e est mesur´ee apr`es une p´eriode de stabilisation de 10 secondes. Les spectres ont ´et´e acquis pour des temp´eratures croissantes puis d´ecroissantes afin de mettre en ´evidence le ph´enom`ene de repliement qui intervient chez toutes
Mat´eriel et M´ethodes Analyses biophysiques : 8.6 les prot´eines ´etudi´ees dans cette th`ese lorsque la temp´erature est abaiss´ee apr`es avoir ´et´e augment´ee.
Le spectre correspondant au tampon seul a ´et´e soustrait de celui correspon- dant `a la prot´eine dans son tampon afin de s’affranchir des variations d’ellipticit´e dues `a ce dernier. Enfin, pour faciliter leur visualisation, l’ellipticit´e r´esiduelle des diff´erentes courbes a ´et´e ajust´ee de sorte que toutes soient ´egales `a 4°C.
8.5.3
Interpr´etation des r´esultats
Le spectre de CD est indicatif du type de repliement en structure secondaire de la prot´eine ´etudi´ee (d´ecrit pr´ecedemment dans le paragraphe Principes).
La temp´erature de fusion de la prot´eine peut se calculer selon la m´ethode ci- dessous :
A partir de la courbe de d´enaturation thermique, il est possible de calculer la constante d’´equilibre K(T) selon l’´equation :
K(T ) = fU fF
= (yF − y) (y − yU)
(8.6) o`u fU et fF sont les fractions de la prot´eine d´epli´ee et repli´ee respectivement
(fU+fF=1), yU et yF les valeurs d’ellipticit´e correspondantes aux ´etats d´epli´e et
repli´e respectivement. Pour chaque valeur de la temp´erature, l’ellipticit´e mesur´ee (y) est alors consid´er´ee comme une combinaison lin´eaire de la valeur de l’ellipticit´e lorsque la prot´eine est compl`etement repli´ee (yF) et lorsqu’elle est compl`etement
d´epli´ee (yU) : y = yFff + yUfU
A l’´equilibre, la variation d’´energie libre se calcule selon
∆G(T ) = −RT ln(K(T )), (8.7) o`u R est la constante des gaz parfaits (R=8,3144 J. mol−1. K−1) et T la temp´erature absolue (en K).
La d´etermination de la courbe ∆G(T) permet alors de d´eterminer graphique- ment la temp´erature de fusion ; elle est telle que ∆G(Tm)=0.