Un jeu de donn´ees `a 2.2 ˚A a ´et´e obtenu apr`es trempage d’un cristal dans une solution de 25 mM de Tris-dipicolinate lut´etium (atome lourd de la famille des lanthanides) afin d’obtenir un cristal de prot´eine dans lequel un m´etal serait accroch´e et permettrait ainsi le phasage. Ce jeu a ´et´e trait´e de fa¸con anomale afin de d´eterminer si le complexe de Tris-dipicolinate lut´etium s’´etait fix´e, et s’il serait possible de phaser les r´eflexions avec le signal anomal obtenu. Du signal anomal a en effet ´et´e d´etect´e par SHELXD [Sch2002]. Il ´etait ´etonnamment faible mais a permis la d´etection de 3 sites de fixation d’atomes lourds par unit´e asym´etrique, ce qui a permis le phasage avec le programme autoSHARP [dlF1997]. Apr`es modification de solvant, ARP/wARP [Mor2003] a ´et´e capable de construire automatiquement dans la carte de densit´e ´electronique exp´erimentale 200 des 217 r´esidus du complexe ternaire.
Puisque nous disposions ´egalement d’un jeu de donn´ees `a 2.0 ˚A (non tremp´e dans la solution de lut´etium, mais contenant n´eanmoins des ions nickel de la solution de cristallisation), nous avons, dans un but p´edagogique et aussi pour am´eliorer la pr´ecision du mod`ele, fait du remplacement mol´eculaire en injectant les phases du mod`ele construit pr´ec´edemment dans le jeu de donn´ees collect´ees `a 2.0 ˚A, ceci afin d’am´eliorer la pr´ecision du mod`ele.
Le mod`ele a ensuite ´et´e affin´e par la suite CNS [Bru1998] et manuellement avec Coot (www.ysbl.york.ac.uk/∼emsley/coot) jusqu’`a obtenir des param`etres
st´er´eochimiques corrects en terme d’angles et de longueur de liaisons atomiques, ainsi que des donn´ees statistiques satisfaisantes en terme de facteur R (Rf ree=23.5%
et R=20.7%).
Au cours de l’affinement, il s’est av´er´e que la densit´e ´electronique obtenue pour les atomes lourds ne correspondait pas `a celle attendue pour le lut´etium (beaucoup
Fig. 14.4 – Spectre d’absorption th´eorique du nickel en fonction de l’´energie des rayons X. Les coefficients f ’ et f ” sont report´es. A la longueur d’onde `a la- quelle les donn´ees ont ´et´e collect´ees, le f ” ne vaut qu’environ 1,3 ´electrons (d’apr`es http://skuld.bmsc.washington.edu/cgi-bin/edgeplots).
trop faible) mais correspondait bien `a la densit´e ´electronique pour des ions nickel. De plus, le complexe de Tris-dipicolinate qui aurait dˆu accompagner le lut´etium n’a pas pu ˆetre observ´e sur la carte de densit´e ´electronique, et enfin la coordina- tion observ´ee n’´etait pas celle attendue pour le complexe de Tris-dipicolinate mais correspondait tr`es bien `a la coordination d’ions nickel. Ainsi, ce ne sont pas 3 com- plexes de Tris-dipicolinate lut´ecium mais 3 ions nickel, provenant de la condition de cristallisation, qui se sont fix´es sur la prot´eine. Ceci explique pourquoi le signal anomal d´etect´e ´etait si faible.
Ce phasage inattendu par m´ethode SAD loin du seuil d’absorption au Ni qui n’a un facteur f” ≈ 1,3 ´electrons `a 0,933 ˚A, longueur d’onde `a laquelle le jeu de donn´ees a ´et´e collect´e (figure 14.4), a ´et´e rendu possible par la haute qualit´e des donn´ees en terme de r´esolution, de mosa¨ıcit´e et de multiplicit´e (multiplicit´e de 18.7 pour le jeu `a 2.0 ˚A, li´ee `a la haute sym´etrie du groupe d’espace P6222 et `a la
collecte des donn´ees sur 180°). Cette strat´egie qui consiste `a phaser les r´eflexions avec des atomes dot´es d’un plus faible nombre d’´electrons (Nickel, Cuivre) que les atomes lourds classiques (Platine, Or, Mercure) et loin de leur seuil d’absorption a ´et´e discut´ee r´ecemment [Leo2005].
R´esultats structure de PscE:PscF55−85:PscG : 14.5
Tab. 14.1 – Statistiques pour la collecte des donn´ees, le phasage et l’affinement de la structure de PscE:PscF55−85:PscG. Les statistiques d’indexation sont celles issues de Scalepack. Les valeurs entre parenth`ese sont celles de la derni`ere tranche de r´esolution.
Jeu de donn´ees I `a 2,2˚A Jeu de donn´ees II `a 2,0˚A Collecte des donn´ees et phasage
Param`etres de maille (˚A ) a=b=85.3, c=157.6 a=b=85.3, c=157.6 α = β=90°, γ=120° α = β=90°, γ=120°
Groupe d’espace P6222 P6222
Longueur d’onde (˚A) 0.933 0.933
Tanche de r´esolution (˚A) 30-2.2 30-2.0
Nombre de r´eflexions uniques/totales 17829/277755 23598/441275
Compl´etude (%) 99.6 (99.3) 99.4 (97.8)
Multiplicit´e moyenne des r´eflexions 15.6 18.7
Rsym(%) 5.1 (25.9) 4.7 (11.37)
I/σI 39.9 (13.1) 48.15 (8.9)
Pouvoir de phasage 0.74
Figure-de-m´erite
Apr`es SHARP (centrique/acentrique) 0.24/ 0.05 Apr`es modification de solvant 0.88
Affinement
Rwork/Rf ree 20.7/23.5
Nombre de r´esidus dans PscE/PscF/PscG 70/32/112
Nombre de mol´ecules d’eau 197
Nombre d’ions Ni2+ 3 3
Facteur B moyen (˚A2):
pour la prot´eine 37.6
pour le solvant 44.8
D´eviation r.m.s pour les liaisons (˚A) 0.02
Chapitre 15
Description de la structure de
PscE:PscF
55−85
-PscG
La r´esolution de cette structure nous permet pour la premi`ere fois de d´ecrire la structure tridimensionnelle `a haute r´esolution d’un fragment du monom`ere de l’aiguille de s´ecr´etion de type III, PscF, en complexe avec ses deux prot´eines par- tenaires PscE et PscG.
Dans ce chapitre, apr`es une description g´en´erale du trim`ere, la structure de chacune des prot´eines impliqu´ees sera d´ecrite plus pr´ecis´ement.
15.1
Description g´en´erale
Dans le complexe PscE:PscF55−85:PscG, les trois prot´eines sont majoritaire- ment repli´ees en h´elices α (figure 15.1). PscE est repli´ee en 2 grandes h´elices α antiparall`eles (Hb et Hc) pr´ec´ed´ees d’une petite h´elice α (Ha) `a l’extr´emit´e N- terminale. Le repliement de PscG en 7 h´elices α antiparall`eles (H1-H7) est sem- blable `a celui d’un domaine ”t´etratricopeptide repeat” (TPR), bien que PscG ne poss`ede pas la s´equence canonique d’un domaine TPR et qu’un tel repliement n’´etait donc pas attendu. La partie tronqu´ee de PscF pr´esente dans la structure cristallographique, loin d’ˆetre compl`etement ´etendue comme ce qui avait ´et´e pro- pos´e par Stebbins et Galan [Ste2001] pour les prot´eines maintenues sous forme monom´erique par des prot´eines chaperonnes, poss`ede une h´elice α amphiphile (H) `
Fig. 15.1 – Structure cristallographique de PscE:PscF55−85-PscG (code PDB 2UWJ). PscE est repr´esent´e en bleu, PscF en rouge et PscG en vert (d’apr`es Quinaud et al., 2007 [Qui2007]).
R´esultats Description de la structure : 15.2 dans la structure cristallographique (r´esidus 55-67) est maintenu d´epli´e par des contacts hydrophobes sur la surface de PscG. Il est `a noter que de la mˆeme fa¸con, les chaperonnes CesT et SigE maintiennent leur effecteur respectif Tir et SigD dans une forme partiellement, et non totalement, d´epli´ee [Luo2001].