La structure de la flagelline F41 enti`ere ainsi qu’un mod`ele d’assemblage du fi- lament de type R ont pu ˆetre propos´es en 2003 dans le laboratoire de Namba sur la base d’une carte de densit´e ´electronique obtenue par cryo-microscopie ´electronique
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a une r´esolution de 4 ˚A et des donn´ees cristallographiques du fragment mo- nom´erique de F41 (figure 6.4) [Yon2003]. La carte de densit´e ´electronique `a cette r´esolution permet en effet de distinguer la chaˆıne principale ainsi que les chaˆınes lat´erales les plus volumineuses.
La structure de la forme enti`ere de F41 (figure 6.3-a) r´ev`ele un repliement du domaine D0 en 2 h´elices α, l’une correspondant au domaine C-terminal de D0 (CD0) et l’autre `a son domaine N-terminal (ND0), organis´ees en coiled-coil. Deux boucles relient les domaines CD0 et ND0 aux domaine CD1 et ND1 respectivement. La comparaison entre la structure cristallographique du fragment de F41 et la structure `a une r´esolution de 4 ˚A obtenue par cryo-microscopie ´electronique montre des modifications dans les domaines D1 et D3 mettant en ´evidence des d´eformations induites par l’assemblage du filament ou par l’empilement cristallin. L’h´elice du domaine CD1 est en particulier courb´ee dans le cas du fragment de F41 alors qu’elle est quasiment droite dans le cas de la prot´eine enti`ere assembl´ee en filaments.
L’assemblage du tube interne est assur´e par des interactions hydrophobes im- portantes entre les domaines D0 au coeur du filament (figure 6.3-b). L’assem- blage du tube externe est lui maintenu par des interactions polaires ou charg´ees principalement (quelques interactions hydrophobes faibles participent elles aussi `a la stabilisation). Peu d’interactions existent entre les tubes internes et externes ; celles-ci apparaissent entre l’extr´emit´e N-terminale du domaine ND0 et la partie C-terminale du domaine CD1 et se pr´esentent sous la forme d’interactions hydro- phobes entre les 2 h´elices antiparall`eles. Ainsi, conform´ement `a ce qui avait ´et´e pr´edit suite `a l’identification des r´ep´etitions hepta´edriques qui laissent supposer la pr´esence de motifs coiled-coil aux extr´emit´es de la flagelline, ce sont principalement des interactions hydrophobes qui stabilisent le filament flagellaire.
Le canal au centre du filament flagellaire a un diam`etre de 20 ˚A et sa surface interne est principalement tapiss´ee de r´esidus polaires avec ´egalement la pr´esence d’un r´esidus charg´e positivement ; l’arginine 494.
6.2.1
Mod`ele d’assemblage du flagelle
L’assemblage du flagelle se fait de fa¸con s´equentielle, de l’extr´emit´e proximale vers l’extr´emit´e distale. Cet ordre est assur´e par 2 facteurs principaux :
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Etat de l’art Flagelle : 6.2
(a) (b)
Fig. 6.4 – Structure cristallographique de F41. Elle a ´et´e d´etermin´ee `a une r´esolution de 4 ˚A par cryo-microscopie ´electronique (code PDB 1UCU). (a) Structure du monom`ere montrant le domaine D0 `a l’extr´emit´e du domaine D1. Le domaine D0 est principalement h´elico¨ıdal et est lui aussi divis´e en une partie C-terminale CD0 et une partie N-terminale ND0, tout comme D1 est divis´e en CD1 et ND1. Les r´esidus du domaine D0 avaient dˆu ˆetre tronqu´es pour obtenir la forme soluble qui avait permis l’obtention de la structure du fragment de F41 par cristallographie des rayons X. (b) Des- cription de l’assemblage du filament flagellaire. Le domaine D0 forme le tube interne, le domaine D1 forme le tube externe et les domaines D2 et D3 constituent l’ext´erieur du filament flagellaire (d’apr`es Yonekura et al., 2003 [Yon2003]).
D’une part, les g`enes codant pour les prot´eines du syst`eme flagellaire sont dispos´es selon la hi´erarchie de l’assemblage, de sorte que les sous-unit´es soient synth´etis´ees au moment d’ˆetre utilis´ees [Fer2006].
D’autre part, il existe des syst`emes de r´egulation de la sp´ecificit´e du syst`eme d’exportation qui r´egulent l’exportation des prot´eines par le syst`eme d’exportation de type III du flagelle [Min1999].
Assemblage de la base
La premi`ere ´etape de l’assemblage consiste en la formation de la base au niveau de la membrane plasmique bact´erienne [Min1999].
A travers cet anneau, des prot´eines flagellaires peuvent alors ˆetre export´ees s´electivement grˆace `a un syst`eme d’exportation similaire au syst`eme d’exportation de type III [Min1999].
Assemblage du crochet
Lors de l’assemblage du crochet, les mol´ecules polym´erisent `a l’extr´emit´e distale du crochet. Le complexe prot´eique HAP1-HAP3 se positionne alors `a l’extr´emit´e du crochet, puis lorsque ce dernier a atteint sa longueur fonctionnelle un pentam`ere de HAP2 vient former une coiffe au dessus du crochet et de HAP1-HAP3 (figure 6.1, p. 92) [Suz1978, Hom1985, Yon2000].
Assemblage du filament
Les mol´ecules de flagelline, apr`es avoir ´et´e synth´etis´ees dans la cellule, sont alors export´ees `a travers le flagelle en cours d’assemblage dans un ´etat partiellement d´epli´e. L’int´erieur du canal interne mesure en effet 20 ˚A de diam`etre [Yon2000], ce qui ne permet pas le passage des mol´ecules de flagelline repli´ees [Mim1995]. En outre, la nature polaire des r´esidus de la surface interne du canal facilite la diffusion rapide des prot´eines d´epli´ees qui ont de larges surfaces hydrophobes expos´ees.
Elles polym´erisent `a l’extr´emit´e distale du filament en formation [Eme1970] grˆace `a la ’chambre’ `a l’extr´emit´e du filament qui ne peut abriter qu’une mol´ecule `
a la fois et lui permet de se replier en la prot´egeant de l’agr´egation avec d’autres mol´ecules [Yon2000].
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Etat de l’art Flagelle : 6.2 La coiffe bloque la fuite des monom`eres dans l’espace inter-cellulaire avant leur polym´erisation ; en cela elle est n´ecessaire `a la polym´erisation correcte du flagelle [Yon2000]. On remarque ici une diff´erence avec le T3SS puisque chez ce dernier aucune structure semblable n’a ´et´e identifi´ee. La prot´eine translocatrice de la fa- mille de LcrV serait en effet un candidat possible pour jouer ce rˆole puisque c’est une prot´eine qui s’associe `a l’aiguille de s´ecr´etion [Mue2005, Esp2006]. Cependant, mˆeme en l’absence de PcrV, les aiguilles de type III de P. aeruginosa se forment [Gou2005]. Cette prot´eine n’est donc pas n´ecessaire `a la polym´erisation de l’aiguille de type III.
Fig. 6.5 –Mod`ele propos´e pour l’addition des monom`eres de flagelline. HAP2 forme une coiffe pentam´erique `a l’extr´emit´e distale du filament, qui garantit un espace qui sert de chambre de repliement pour une mol´ecule de flagelline isol´ee et empˆeche la fuite des monom`eres avant leur polym´erisation. La rotation de la coiffe permet l’addition des monom`eres s´epar´ement `a l’extr´emit´e distale du filament. (d’apr`es Yonekura et al., 2000 [Yon2000]).
Un mod`ele de polym´erisation des sous-unit´es de flagelline `a l’extr´emit´e distale du flagelle a ´et´e propos´e par Namba et son ´equipe [Yon2000] (figure 6.5).
Lors de l’addition de chaque mol´ecule de flagelline la coiffe est d´eplac´ee de 4,7 ˚A vers le haut et subit une rotation de 6,5˚.
Ainsi, une rotation d’un tour de la coiffe permet l’addition de 3606,5 ≈55 sous- unit´es. De cette fa¸con, l’´energie n´ecessaire `a la polym´erisation du flagelle serait rela- tivement faible, ce m´ecanisme impliquant un grand nombre de petits d´eplacements.