L’objectif de cette section est de d´ecrire les cristaux de prot´eine utilis´es pour la diffraction des rayons X. Apr`es avoir introduit le processus de cristallogen`ese nous d´ecrirons bri`evement les r´eseaux cristallins en introduisant les param`etres qui seront utilis´es dans les sections suivantes traitant de la r´esolution d’une structure de prot´eine par cristallographie.
10.2.1
Cristallogen`ese
La cristallogen`ese est bien entendu la premi`ere ´etape vers la r´esolution de la structure d’une prot´eine, une fois que celle ci est produite en grande quan- tit´e (quelques mg) et pure. Dans cette partie nous ´etudierons le principe et une technique mises en oeuvre afin d’obtenir ces (magnifiques) cristaux de prot´eine [Duc1992].
Principe
L’´etape de cristallisation est encore peu contrˆol´ee et est conduite de fa¸con largement empirique.
Dans le diagramme de phase d’une prot´eine (figure 10.1-a), entre la zone de solubilit´e et la zone de pr´ecipitation, figure une ´etroite bande de sursaturation o`u la prot´eine peut cristalliser.
La solubilit´e d’une prot´eine d´epend de nombreux param`etres comme sa concen- tration, le pH, la temp´erature, la pr´esence d’agents pr´ecipitants (notamment le PEG et/ou des sels chaotropiques `a haute concentration) ou solubilisants (sels `a basse concentration par exemple). L’aspect cin´etique est lui aussi important. Le travail de cristallogen`ese consiste `a modifier ces diff´erents param`etres afin que la prot´eine cristallise.
La sursaturation, rapport entre la concentration initiale en solut´e/prot´eine et la concentration `a l’´equilibre, est la force motrice des processus de nucl´eation et de croissance cristalline.
La premi`ere ´etape de la cristallisation consiste `a rendre les prot´eines insolubles suite `a l’ajout d’agents pr´ecipitants afin d’amener les prot´eines dans la partie m´etastable de la zone de sursaturation o`u les nuclei ou pr´ecipit´es cristallins se
Mat´eriel et M´ethodes cristallographie : 10.2
(a) (b)
Fig. 10.1 – Processus de cristallogen`ese. (a) Diagramme de phase d´ecrivant le processus de cristallisation d’une prot´eine par diffusion de vapeur et (b) mise en oeuvre exp´erimentale de la technique de diffusion de vapeur par goutte suspendue (b).
forment. Suite `a cela la sursaturation des prot´eines dans le reste de la goutte de cristallisation diminue, ce qui permet de repasser dans le domaine de sursaturation propice `a la croissance cristalline. Cette derni`ere se poursuit alors autour des nuclei form´es pr´ec´edemment et la taille des cristaux augmente, jusqu’`a ce qu’il n’y ait plus de prot´eine disponible dans la goutte ou que la croissance cristalline soit interrompue suite `a de trop nombreux d´efauts de cristallisation (irr´egularit´es dans la maille, addition de mol´ecules l´eg`erement diff´erentes).
Mise en oeuvre
Pour cela, la technique la plus couramment utilis´ee au laboratoire est la m´ethode par diffusion de vapeur en goutte suspendue [McP1995, Duc1992]. Elle consiste en la diffusion de vapeur entre une goutte de solution prot´eique m´elang´ee `a la solution de cristallisation et un r´eservoir de solution de cristallisation qui est un m´elange d’agents pr´ecipitants et solubilisants, et ce jusqu’`a ce que les potentiels chimiques de la goutte et du puits s’´equilibrent.
Pour cela, une goutte d’1 µL de solution de prot´eine est d´epos´ee sur une lamelle de verre silicon´e et 1 µL de solution de cristallisation du puits lui est ajout´e. La
lamelle de verre vient fermer un puits dans lequel 1 mL de solution de r´eservoir a ´et´e d´epos´e, l’´etanch´eit´e est assur´ee par de la graisse de silicone d´epos´ee entre la lamelle et le dessus du puits (figure 10.1-b).
Pendant que les potentiels chimiques s’´equilibrent, le volume de la goutte sus- pendue diminue. Il s’en suit une augmentation de la concentration de prot´eine et de sels dans la goutte, et dans le diagramme des phases la prot´eine est alors dans le domaine de sursaturation ou de pr´ecipitation. C’est l`a que les germes cristallins apparaissent. Puis le processus de croissance cristalline se poursuit, comme d´ecrit pr´ec´edemment (figure 10.1-a).
10.2.2
R´eseaux cristallins
Un cristal est la r´ep´etition p´eriodique d’un motif dans l’espace selon 3 vecteurs non colin´eaires ~a,~b, ~c qui engendrent le r´eseau cristallin. Ces vecteurs d´efinissent la maille du cristal, caract´eris´ee par les normes des vecteurs ~a,~b, ~c et les angles entre eux : α, β, γ [Jan1994].
Parmi les op´erations de sym´etrie de r´eseau possibles, seules les rotations d’ordre 2, 3, 4 ou 6 sont autoris´ees pour les cristaux de prot´eines, ´eventuellement combin´ees `
a des translations selon un vecteur qui est une fraction d’un vecteur du r´eseau cristallin. En effet les centres d’inversion ou de r´eflexion selon un plan conduiraient `
a une modification de la chiralit´e des acides amin´es alors que seuls les acides amin´es L sont pr´esents dans les prot´eines (cette remarque ne s’applique pas aux glycines qui ne sont pas chirales).
L’introduction du concept de r´eseau r´eciproque simplifie la pr´esentation de la th´eorie de la diffraction. Les vecteurs du r´eseau r´eciproque ~a∗, ~b∗, ~c∗ sont construits
`
a partir des vecteurs du r´eseau direct selon ~ a∗ = 1 V~b ⊗ ~c, ~ b∗ = 1 V~c ⊗ ~a, c~ ∗ = 1 V~a ⊗ ~b (10.1) D’o`u, dans un rep`ere orthogonal,
~
a∗· ~a = ~b∗· ~b = ~c∗· ~c = 1 (10.2)
et
~
Mat´eriel et M´ethodes cristallographie : 10.3