Dans ce paragraphe, seules l’acquisition d’un spectre RMN 1D et l’interpr´etation de ce spectre seront expos´ees. La spectroscopie RMN n’´etant pas le sujet de cette th`ese, la th´eorie la concernant ne sera pas abord´ee.
Lors de l’exp´erience de RMN 1D, l’´echantillon prot´eique en solution (400 µL `a 50 µM environ) est introduit dans le spectrom`etre o`u r`egne un champ magn´etique B0 statique tr`es fort et homog`ene. Au laboratoire de RMN de l’IBS (LRMN) les
spectrom`etres utilis´es g´en`erent des champs magn´etiques de 14 et 18,8 T (ce qui correspond `a des fr´equences de 600 et 800 MHz pour les protons). Un champ magn´etique B1 variable et d’amplitude beaucoup plus faible lui est additionn´e par
Mat´eriel et M´ethodes Analyses biophysiques : 8.7 Ce sont les spins 1/2 (principalement les spins des protons des prot´eines) qui interagissent avec B1; ils entrent en r´esonance avec le champ oscillant et oscillent
`
a leur fr´equence de Larmor νL, proportionnelle au champ magn´etique local ”vu”
par le spin consid´er´e, et qui d´epend de l’environnement chimique du noyau. Les variations de la fr´equence de Larmor, bien que tr`es faibles, sont mesurables et ce sont elles qui sont repr´esent´ees sur les spectres de RMN. Leur analyse permet de recueillir des informations sur la structure de la prot´eine [Jan1994].
Cette r´esonance est suivie d’un retour `a l’´equilibre ; c’est la relaxation qui est d’autant plus rapide que les mol´ecules sont grosses. La vitesse de relaxation influe sur la largeur des bandes des spectres de RMN ; plus la prot´eine relaxe rapidement plus les bandes sont larges et le spectre peu r´esolutif. L’observation de la largeur des bandes donne donc acc`es `a une information sur l’´etat d’oligom´erisation ´eventuel de la prot´eine ´etudi´ee (figure 8.2-a).
Les d´eplacements chimiques δ des spins des protons de la prot´eine sont li´es `a la fr´equence de Larmor selon la relation
δ(ppm) = νL− νref νref
×106 (8.8)
o`u νL est la fr´equence de Larmor mesur´ee et νref la fr´equence de r´ef´erence du
T´etram´ethylsilane (TMS, (CH3)4Si), dont les protons sont compl`etement d´eblind´es.
Ce sont les valeurs des d´eplacements chimiques qui sont report´ees sur les spectres RMN.
Le spectre RMN-1D du proton d’une prot´eine repli´ee s’´etend sur environ 15 ppm alors que pour une prot´eine mal repli´ee les pics sont moins dispers´es (figure 8.2- b,c).
Typiquement, les protons des groupes m´ethyles (CH3) ou m´ethyl`enes (CH2)
r´esonent `a fort champ, pour des valeurs de d´eplacement chimique comprises entre 0 et 4 ppm. Les protons NH r´esonnent eux `a des champs plus faibles, entre 6,5 et 9,5 ppm. Leur d´etection peut ˆetre empˆech´ee par la deut´eration de l’´echantillon, en effet ces protons peuvent s’´echanger avec le deut´erium du solvant. Ces pro- tons sont en outre stabilis´es par des liaisons hydrog`enes impliqu´ees dans la struc- ture secondaire en h´elices α ou en feuillets β. L’observation de l’´echange hy- drog`ene/deut´erium (´echange H/D) ´eventuel renseigne donc sur l’organisation en structure secondaire de la prot´eine ´etudi´ee : la persistance des pics caract´eristiques de ces protons apr`es l’ajout de D2O signifie que ceux-ci sont impliqu´es dans les
(a) (b) (c) Fig. 8.2 – Analyse de spectres de RMN-1D. (a) Baisse de r´esolution des pics et donc de la qualit´e du spectre lorsque le poids mol´eculaire de la prot´eine augmente. (b) Dans le cas d’une prot´eine bien repli´ee, les pics sont bien dispers´es dans la r´egion des m´ethyls et des NH. (c) Dans le cas d’une prot´eine mal repli´ee, les pics sont mal dispers´es. Images extraites de www.ibs.fr/content/ibs/presentation/Platform/Facilities/nmr 1d.htm.
liaisons hydrog`enes qui stabilisent les ´el´ements de structure secondaire, et donc que la prot´eine est au moins partiellement repli´ee.
Chapitre 9
M´ethodes de microbiologie et
biologie cellulaire
Les ´etudes dont les protocoles seront d´ecrits dans ce chapitre ont ´et´e r´ealis´ees par le groupe d’Ina Attr´ee (iRTSV).
9.1
Test de cytotoxicit´e
Ce test permet de montrer si P. aeruginosa, modifi´ee ou non, a gard´e un ph´enotype infectieux envers des macrophages. Au laboratoire d’Ina Attr´ee (iRTSV), c’est la lign´ee cellulaire de macrophages J774 qui est utilis´ee. Ces exp´eriences ont ´
et´e effectu´ees en partenariat avec Sophie Pl´e, post-doctorante dans le laboratoire d’Ina Attr´ee.
9.1.1
Pr´eparation de P. aeruginosa et des macrophages
Les pr´ecultures de P. aeruginosa dans LB sont dilu´ees afin d’obtenir une DO600nm=0.2 U.A. dans 3 mL de LB. Les cellules sont laiss´ees `a 37˚C, 220 rpm
jusqu’`a une DO600nm ≈1 U.A., ce qui correspond `a environ 6.108 bact´eries/mL.
Toutes les manipulations sur les macrophages se font dans un environnement st´erile (sous la hotte), dans une pi`ece ´eloign´ee de celle des cultures bact´eriennes. La veille, environ 3.105 macrophages sont d´epos´es par puits dans une boˆıte de 96 puits dans un volume final de 300 µL de DMEM (Gibco), suppl´ement´e avec 10%
de s´erum de boeuf foetal inactiv´e (Gibco). Ils adh`erent au fond des puits et sont laiss´es sur la nuit dans un incubateur `a 37˚C, 5% CO2 . 3 heures avant l’infection,
les macrophages sont lav´es 2 fois : les 300 µL de DMEM sont aspir´es soigneusement et 300 µL de DMEM pr´ealablement chauff´e `a 37˚C sont remis dans chaque puits. Les macrophages sont ensuite replac´es dans l’incubateur `a 37˚C, 5% CO2pendant
3 heures.
9.1.2
Infection
Les macrophages sont infect´es avec une MOI (”Multiplicity Of Infection” : multiplicit´e d’infection) de 5 `a 10 (soit 5 `a 10 bact´eries par macrophage). Afin de servir de t´emoin, un puits non infect´e servira de blanc et permettra de mesurer le bruit de fond (mort naturelle des macrophages). Dans un autre puits, 300 µL de 2% Triton X-100 est d´epos´e, d´etergent qui conduit `a la lyse compl`ete des macrophages. Les macrophages infect´es sont remis `a l’incubateur `a 37˚C, 5%CO2 pendant 3
heures. Suite `a cela, 30 µL de la solution de chaque puits sont pr´elev´es et d´epos´es dans une autre boˆıte 96 puits, `a l’exception de la condition avec le Triton 2% o`u 60 µL sont pr´elev´es.
9.1.3
R´ev´elation
La cytotoxicit´e est ´evalu´ee en mesurant l’activit´e de la Lactate Deshydrog´enase (LDH), enzyme cytoplasmique soluble des macrophages qui est relargu´ee dans le milieu en cas de lyse des macrophages, grˆace au kit de cytotoxicit´e (Cytotoxicity Detection Kit, Rocher). Apr`es avoir laiss´e les r´eactifs agir 2 minutes `a l’obscurit´e, les solutions de puits se colorent en rouge plus ou moins intense, et l’absorbance `a 480 nm est lue par un lecteur de micro-plaques, avec le programme BL4 (Biolyse 4).
L’absorbance lue pour la souche cytotoxique (souche sauvage CHA) correspond `
a une cytotoxicit´e de 100%, et les autres valeurs de cytotoxicit´e sont calcul´ees par proportionnalit´e.
Mat´eriel et M´ethodes M´ethodes de microbiologie : 9.2