I. Principe
La désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) est un mode de production d’ions pour la spectroscopie de masse (SM) dérivé de l’analyse de surface au moyen d’un faisceau laser, appelée désorption/ionisation laser. Le composé organique déposé sur le porte-échantillon absorbe les photons du laser (bande d’absorption à la longueur d’onde du laser λ). L’énergie absorbée se relaxe en éjectant sous vide des particules chargées (électrons, ions positifs et négatifs) ou neutres. L’analyse par spectrométrie de masse des ions ainsi produits permet de caractériser la nature de la surface.
On utilise ce phénomène en MALDI : les biomolécules à analyser sont incorporées dans des cristaux de "matrice" formée de petites molécules organiques absorbant à la longueur d’onde du laser (c'est à dire que la molécule de matrice est ajoutée à la solution à analyser, puis les deux sont coprécipités par évaporation de la phase liquide). La longueur d’onde du laser est choisie de façon à ce que les biomolécules n’absorbent pas les photons laser mais seulement la matrice. Lors de l’absorption d’énergie, les biomolécules ne participent pas à la relaxation
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de l’énergie. Toutefois elles sont entraînées lors de l’éjection de la matrice. Des mécanismes complexes de transfert de protons entre les molécules de matrice et les biomolécules permettent une protonation des biomolécules intactes et donc leur étude dans un analyseur de masse.
II. Mécanismes physico-chimiques conduisant à la production d’ions
En désorption/ionisation laser assistées par matrice, le phénomène final consiste en l’éjection et l’ionisation de biomolécules sous l’impact d’une impulsion laser UV courte (~ nanoseconde). Cette source d’ion est donc pulsée et non continue. Les mécanismes physico-chimiques conduisant à cette production d’ions ne sont pas encore connus avec précision. Les grandes lignes sont les suivantes :
v Absorption des photons UV par les molécules de matrice m. Certaines molécules de matrice peuvent être ionisées par un processus de mise en commun d’énergie (m+ puis mH+).
v Excitation rapide de ces molécules sur une faible profondeur (de l'ordre du mm) conduisant au développement d’une onde de pression dans le matériau. En remontant vers la surface, cette onde conduit à l’éjection d’un plumeau de matière (ablation). v Dans ce plumeau de matière éjectée, des agrégats composés de molécules de matrice
(neutres et ionisées sous forme protonée mH+) et de biomolécules M, des transferts de proton peuvent se produire conduisant à la formation de biomolécules protonées MH+. Ce transfert de proton nécessite que l’affinité protonique de la biomolécule soit supérieure à celle de la matrice. La désolvatation progressive de ces agrégats avec perte de molécules de matrice conduit ultérieurement à des biomolécules possédant un proton, voire plusieurs protons.
v Existence d’une valeur de seuil de l’énergie laser (fluence) pour la production d’ions. Au-delà de ce seuil, la production d’ions augmente suivant une loi de puissance. v Le nombre d’ions générés par un seul tir laser est en général insuffisant pour
l’obtention d’un signal ionique correct reflétant la distribution isotopique. Il est donc nécessaire de sommer ou moyenner les signaux issus d’un grand nombre de tirs laser (d’une dizaine à plusieurs centaines).
m + hn ® m +. (a) m +. + m ® (m+H) ++ (m-H)-(b)
Le transfert de proton de la matrice vers la molécule de protéine ou de peptide s’effectue selon les 2 modèles existant soit en phase gazeuse dans le plumeau de matière éjecté (réaction
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molécule-ion) soit lors de l’éjection d’agrégats matrice molécule (Electrospray and MALDI Mass Spectrometry, Edited by R Cole, 2nd Edition 2010 Wiley).
(m+H)++ M ® m + (M+H)+
L’affinité protonique de la matrice (<200 kcal/mol) étant toujours < à celle des protéines et peptides (~230 kcal/mol) le transfert de proton vers la biomolécule est favorisé.
III. Spectromètre MALDI-TOF : Appareillage et conditions opératoire
Les spectres MALDI (mode positif et négatif) sont enregistrés sur un spectromètre 4700 Proteomics Analyser ABI SCIEX. L’énergie laser est ajustée un peu au-dessus du seuil de production des ions de façon à produire les ions de produit attendus (monomères, dimères trimères sous forme linéaire et/ou cyclique) en évitant une saturation du détecteur par les ions de matrice (HCCA). Les spectres sont étalonnés de façon interne (à partir des pics mono-isotopiques des ions mH+ et 2mH+ de la matrice) ou de façon externe sur un échantillon voisin contenant un mélange de produits connus (AMP, Adénine, Adénosine).
La production d’ions en MALDI nécessite en premier lieu des molécules de matrice absorbant
à la longueur d’onde du laser (З=355 nm (NdYAG) ou 337 nm (laser N2)), HCCA est la
matrice utilisée dans notre travail.
La réalisation de cible en MALDI consiste à mélanger un petit volume v d’une solution diluée du produit d’intérêt avec un volume v’ de la matrice (concentrée). Matrice et biomolécules doivent posséder des solvants communs. Un très faible volume (<= 1µl) est alors déposé sur
un support métallique. L’évaporation progressive du solvant (typiquement acétonitrile : H2O
50 :50 contenant 0,1%TFA) conduit à la formation de micro-cristaux à l’intérieur desquels les biomolécules sont incluses.
Dans ce travail, le rapport du mélange matrice (HCCA) –solution est 1μLde HCCA (8 mg/ml) avec ~ 1μL du filtrat de la solution désorbée.
Le logiciel Data Explorer version 4.6 est utilisé pour l’analyse des spectres MS.
Afin de pouvoir calculer les rendements de la formation d’adénosine dans les différentes conditions expérimentales étudiées dans la partie glycosylation, on a analysé une solution équimolaire d’adénosine et d’adénine en MALDI. Le spectre obtenu présente, en plus des pics de la matrice, deux pics d’intensités presque égale à 100%. Ces deux pics sont respectivement caractéristiques d’adénine (MH+= 136,0 uma) et d’adénosine (MH+= 268,0). Ce résultat indique que les deux produits présentent le même facteur de réponse en spectrométrie de
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masse MALDI ce qui rend possible le calcul de rendement. Le spectre obtenu est présenté ci-dessous.
Figure III-5 : Analyse MALDI d’une solution équimolaire d’adénine-adénosine.
Cependant, nous n’avons pas passé une solution équimolaire contenant l’AMP ce qui nous empêche de calculer son rendement de formation dans notre étude.