Le séquençage automatique

5 Réalisé au Service Commun de Séquençage de l’IFR 30 (CNRS, Purpan).

6 Réalisé au Laboratoire d’Anthropologie Moléculaire de Strasbourg par S. Romac.

7 Réalisé au Service Commun de Séquençage de l’IFR 30 (CNRS, Purpan).

8 Ces analyses ont été faites dans le laboratoire d’Anthropobiologie de Toulouse.

d’obtenir la séquence complète de HVII mais permet l’analyse de la région entourant la position 189. La région HVIII n’a pas été analysée sur ces échantillons (tableau 8).

Nous avons effectué l’analyse des séquences sur les deux brins L et H de l’ADNmt pour chaque échantillon afin de confirmer les hétéroplasmies. Elles sont analysées comme telle seulement quand les deux bases sur la même position sont visibles sur les deux brins et supérieures au bruit de fond (Tully et al. 2001). Un témoin positif et la séquence du manipulateur sont analysés systématiquement pour s’assurer de la non-contamination des échantillons.

Les extraits ADN des échantillons osseux modernes et anciens étaient très fragmentés, de part leur traitement ou leur état de conservation, nous avons donc effectué deux séquençages indépendants sur les deux brins pour chaque échantillon.

Une première réaction de polymérisation en chaîne (PCR) est effectuée afin d’amplifier à partir de chaque échantillon les fragments d’intérêt.

L’amplification PCR est réalisée en utilisant 1µl d’ADN total, la concentration ADN des extraits n’est pas quantifiée et pouvait donc varier d’un échantillon à l’autre. La réaction de PCR a lieu dans un volume de 50µl contenant : 1,5 mM de MgCl2, 200 nM de dNTPs, les amorces spécifiques à 200 nM, du tampon 1X and 0.5 U de polymérase ADN Taq HotGoldstar (Eurogentec). Les amorces correspondantes au segment d’intérêt et leurs séquences sont indiquées dans le tableau 8.

L’amplification ADN de chaque segment cible a été réalisée dans un thermocycleur T3 (Biometra) ou dans un thermocycleur Perkin Elmer 2400 selon les laboratoires.

L’amplification est effectuée par une 1° étape de dénaturation à 94°C pendant 10 minutes, suivit de 35 cycles comprenant: une dénaturation à 94°C de 45 secondes, une hybridation à 53°C pour HVII (incluant les 2 possibilités de segments de 373 et 260 pb) et pour le segment complet de 413 pb englobant les 2 régions, et à 58°C pour HVIII et pour le segment de 160 pb de HVII pendant 1 minute, et une élongation à 72°C pendant 1 minute. Un cycle d’élongation final à 72°C pendant 7 minutes permet d’amplifier la totalité des segments amorcés (voir tableau 8).

Comme précisé dans le paragraphe 1.2.2, un blanc est réalisé (témoin négatif) afin de vérifier les possibilités de contamination à cette étape.

Les produits d’amplification sont ensuite analysés par électrophorèse sur un gel d’agarose à 2% (2 g d’agarose dans 100 ml de TAE 1X (400mM Tris-Acetate, 10 mM EDTA)). Cinq µl de BET (Bromure d’Ethidium à 10 mg/ml) sont ajoutés à 50 ml de gel pour permettre la visualisation sous UV. Les échantillons sont mélangés à du Bleu de Bromophénol 1X pour suivre leurs migrations sur le gel. Un marqueur de taille de 100 pb est ajouté dans un puits (15% Ficoll, 0,03% bromophenol blue, 0,03% xylene cyanol, 0,4% orange G, 10 mM Tris-HCl(pH 7,5) et 50 mM EDTA (Promega)) pour contrôler la taille des fragments obtenus.

L’électrophorèse est réalisée pendant 30 minutes sous 100 Volts.

La visualisation des bandes est faite sous lumière UV analytique (BioRad. Gel Doc 1000).

La taille des fragments obtenus est comparée au marqueur de taille de 100 pb pour vérifier que la taille des fragments correspond à celle des régions recherchées. La concentration des fragments amplifiés à partir de chaque échantillon est estimée par comparaison de l’intensité de fluorescence (proportionnelle à la quantité d’ADN) à un fragment de concentration connue : le fragment de 500 pb à 160 ng/µl du marqueur de poids moléculaire. A partir de cette estimation de la concentration des fragments de chaque échantillon nous ajusterons la concentration nécessaire à 2 ng/µl pour réaliser la réaction de PCR permettant l’incorporation des didésoxynucléotides fluorescents.

La purification des produits d’amplification de cette première PCR est réalisée par ultracentrifugation au moyen soit de colonnes Microcon®PCR (Millipore) pour les analyses effectuées à Strasbourg, soit de colonnes du Kit QIAquick® gel extraction (QIAGEN) pour les analyses réalisées à Toulouse. Cette étape (quelle que soit la technique de purification utilisée) permet l’élimination des sels, des amorces et des dNTPs qui sont présents en excès dans le milieu réactionnel. Un volume final de TE 1X (Tris EDTA) calculé est ajouté au concentrât pour obtenir une concentration finale de 2 ng/µl.

Les séquences sont réalisées à partir des fragments précédemment amplifiés et en utilisant le Kit BigDye^™ Terminator (Applied Biosystems). Cette étape permet l’incorporation des deux types de nucléotides, dNTPs et ddNTPs , dans un seul brin (Forward ou 5’ et Reverse ou 3’) au cours de la réaction et permettra ensuite l’analyse sur un séquenceur automatique ABI Prism ® 310 ou 3100 (suivant les laboratoires; Applied Biosystems) de chaque brin marqué par fluorescence.

A 2 µl de produit d’amplification purifié (à une concentration de 2 ng/µl) sont ajoutés 4 µl de mix contenant les 4 dNTPs et les 4ddNTPs fluorescents et une ADN polymérase. A ce mélange sont ajoutés 2 µl de l’une des amorces spécifiées dans le tableau à une concentration de 0,8 µM et qui détermineront le sens de lecture de la polymérase et l’amplification d’un seul brin (5’ ou 3’), et enfin 2 µl d’eau MilliQ® stérile (Millipore). Ainsi, chaque brin d’un fragment donné est séquencé séparément, les 4 ddNTPs incorporés sont marqués par un fluorochrome différent.

La PCR BigDye^™ Terminator est effectuée dans des conditions identiques quelque soit le segment. Elle comprend un première étape de dénaturation à 96°C de 10 secondes, suivit de 25 cycles d’amplification incluant une dénaturation à 96°C de 35 secondes, une hybridation à 50°C de 15 secondes et une élongation à 60°C de 4 minutes.

Les produits d’extension de la PCR BigDye^™ Terminator sont purifiés par précipitation avec des solutions d’éthanol de concentration décroissante (95% puis 70%), séchés à température ambiante, puis mis en suspension dans 10 µl d’eau MilliQ® stérile. Cette étape permet l’élimination maximum de sels, d’amorces et de dNTPs en excès. Elle est très importante car si elle s’est correctement déroulée, l’électrophorégramme, obtenu après migration dans le capillaire du séquenceur automatique, présente peu de “bruit de fond”.

Les séquences obtenues sont analysées sur les séquenceurs ABI Prism ® 310 ou 3100 à l’aide du logiciel Sequencing Analysis 3.7 (Applied Biosystems) qui permet l’identification de chaque pic et leur attribution à un nucléotide en fonction de la couleur du fluorochrome.

L’alignement des séquences par rapport à la séquence de Cambridge est réalisée par le logiciel BioEdit (Ibis Therapeutics), afin d’identifier les polymorphismes individuels. Les hétéroplasmies sont identifiées par le logiciel Sequencing Analysis 3.7 et visualisé et confirmé par l’analyste selon les conditions décrites précédemment.

Tableau 8 : Liste des amorces utilisées lors du séquençage automatique.

L’hybridation des amorces s’effectuent à une température de 53°C pour les segments de 373 pb, 260 pb et 413 pb et à une température de 58°C pour les segments de 232 pb et 160 pb.

Région longueur Amorces Séquence (5’-3’) selon Anderson et al. (1981) Amorce 5’: L29 GGT CTA TCA CCC TAT TAA CCA C

Nous avons testé la limite de détection de la technique de séquençage automatique pour la mutation 189 à partir de deux extraits d’échantillons musculaires. Ces échantillons que nous appellerons “contrôles” ont été auparavant séquencés et identifiés comme A (wild-type = WT) ou G (mutant = M) à la position 189. A partir de ces deux contrôles, nous avons préparé sept points (dans les pourcentages suivants : 0, 10, 20, 30, 40, 50 et 100%), en mélangeant dans des proportions équimolaires les ADN des contrôles M et WT.

Un dosage par spectrophotométrie de la concentration ADN de chacun permet de mesurer une concentration initiale de 1 µg/µl. Nous avons préparé ensuite pour chaque point des aliquots de volume final de 10 µl, et mélangé dans les volumes adéquats les deux contrôles. Par exemple : pour le variant G de 10%, 1 µl de contrôle M et 9 µl de contrôle WT sont mélangés et homogénéisés, ensuite 1 µl est prélevé pour la première PCR de séquençage. Ces “variants”

G sont soumis au séquençage automatique selon le même protocole que les échantillons.